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T4 DNA连接酶
T4 DNA Ligase
该酶催化双链 DNA 或 RNA 上相邻的 5´ -磷酸末端和 3´ -羟基末端形成磷酸二酯键。该酶不仅能够催化平齐末端或粘性末端之间的连接，还可以修复双链 DNA、RNA 或 DNA/RNA 杂交双链中的单链切刻。
图：在含有荧光标记单链、平末端双链、3´ 或 5´ 突出末端的寡核苷酸反应中，对不同供应商的 T4 DNA 连接酶进行测试。通过毛细管电泳和峰值分析确定核酸酶污染的降解百分比。分辨率达到单核苷酸水平。
1、单位定义
1 单位是指在 20 µl 反应体系，1X T4 DNA 连接酶反应缓冲液中，16℃ 条件下 30 分钟内能使 50% 的经 HindIII 消化的 λ DNA 片段 [DNA 5´ 末端浓度为 0.12 µM (300 μg/ml)] 连接所需的酶量。
2、浓度
400,000 粘性末端单位/ml 和 2,000,000 粘性末端单位/ml
3、反应条件
1X T4 DNA 连接酶反应缓冲液
Incubate at 16°C
1X T4 DNA 连接酶反应缓冲液
50 mM Tris-HCl
10 mM MgCl2
1 mM ATP
10 mM DTT
(pH 7.5 @ 25°C)
4、贮存溶液
10 mM Tris-HCl
50 mM KCl
1 mM DTT
0.1 mM EDTA
50% Glycerol
pH 7.4 @ 25°C
5、热失活
65°C for 10 minutes
6、贮存条件
建议将试剂盒贮存于 -20℃。
7、注意事项
（1）ATP 是反应中必不可少的辅因子。这与需要 NAD 作为辅因子的 E. coli DNA 连接酶不同。
（2）若需稀释 T4 DNA 连接酶，推荐使用含 50% 甘油的贮存缓冲液（稀释缓冲液 A，NEB #B8001S）稀释，然后于 -20℃ 贮存。如稀释后立即使用，也可以使用 1X T4 DNA 连接酶反应缓冲液稀释。
（3）连接反应可以在添加 1 mM ATP 的四种限制性内切酶缓冲液的任何一种或在 T4 多聚核苷酸激酶（T4 PNK）缓冲液中进行。
（4）室温连接
为方便起见，连接可在室温（20 - 25℃）条件下进行。连接粘性末端，在 20 µl 反应体系中加入 1 µl T4 DNA 连接酶，反应 10 分钟。连接平末端，在 20 µl 的反应体系中加入 1 µl 的 T4 DNA 连接酶，反应 2 小时；或者加入 1 µl 高浓度的 T4 DNA 连接酶反应 10 分钟。此外，也可选择 NEB Quick Ligation 快速连接试剂盒（#M2200S）[30 次反应] 或（#M2200L）[150 次反应]），在室温条件下反应 5 分钟，即可完成 DNA 平末端和粘性末端的连接。
| 货号 | 产品名称 | 单位 | 购买 |
|---|---|---|---|
| 243-MCT-C-0.6-BAG | 0.6 ml 微量离心管 | 1000 个/盒 | 商城订购 |
| SI-0246 | Vortex-Genie2 多功能漩涡振荡器 | 1 set | 商城订购 |
| 244-PCR-C-0.2-BAG | 0.2ml PCR管 | 1000 个/包 | 商城订购 |
| 4381 | 0.1-2ul单道移液器 | 1 unit | 商城订购 |
| 4382 | 0.5-10ul单道移液器 | 1 unit | 商城订购 |
| 221-R-C-10S | 0.5-10ul 盒装灭菌吸头 | 96支/盒，10盒/组，5组/箱 | 商城订购 |
| 货号 | 名称 | 单位 | 购买 |
|---|---|---|---|
| M0202L | T4 DNA连接酶 | 100,000 units | 商城订购 |
| M0202M | T4 DNA连接酶 | 高浓度，100,000 units | 商城订购 |
| M0202S | T4 DNA连接酶 | 20,000 units | 商城订购 |
| M0202V | T4 DNA连接酶 | 10,000 units | 商城订购 |
