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尊敬的客户：
您好！
藉由良好的售后和管理，基因有限公司竭诚为您服务，有任何关于试剂的疑问，请您在本页的常见问题解答栏目中搜索相关答案。 若仍然无法解决您的问题，您可阐明问题，提交下表，基因有限公司的服务人员将第一时间联系您，做初步诊断和后续的售后工作。 以便能快速判断问题和解决您的问题。
感谢您对基因有限公司的信赖！
基因有限公司试剂市场部
邮箱：shrcts@genecompany.com
联系方式：技术人员企业微信
Q：我该如何找到我需要的抗体？多个货号时如何选择？
A：当选择抗体时，研究人员其实在寻找一种产品，该产品已在他们正在研究的物种以及他们希望操作的应用中验证过。CST产品网页上，通过验证的应用显示在最上方和产品使用部分。已验证过的物种在实验结果图片下方支持数据内反应性部分。
研究人员也需要查看产品网页中“敏感性”的部分。大多数CST抗体被批准用于检测适当模型系统中蛋白的内源性水平。然而，一些抗体仅被批准用于检测靶蛋白过表达的样本，或者重组蛋白。
Q：抗体名称中，括号中的内容是什么意思？
A：抗体名称括号中的数字和字母为克隆号。克隆号在历史上被用于区分不同的单克隆抗体。所以，如果两个抗体有同样的克隆号，那么他们是相同的抗体，即便由不同的供应商出售。虽然克隆号仍在使用，Research Resource Identifiers (RRIDs) 正在开始替代克隆标识，用来区分特定的抗体。CST抗体的RRID号可在 https://scicrunch.org 中查询。
Q：为什么有些反应性中的种属加了括号？
A：如果括号中显示的是一个物种，则意味着该物种的反应性尚未通过CST验证，但是抗原序列与该物种的目标蛋白序列具有100%同源性，因此预测抗体会发生反应。需要注意的是，CST的《抗体性能保证》不适用于根据100%序列同源性预测会发生反应的物种。
Q：如何判断抗体是多抗还是单抗？
A：产品名称中，写有“mAb”的，即为单克隆抗体。
Q：为什么我输入的靶标和搜索结果中的靶标不一致？是我需要的抗体吗？
A：有些蛋白质有多个已被接受的名称和/或缩写。如要确认您查看的抗体是否为您的目标蛋白，可以查看产品网页底部的UniProt ID或Entrez-Gene ID。
Q：为什么抗体的说明书中的分子量和数据库预测分子量有偏差？
A：CST网页/说明书中提供的分子量是Tris-甘氨酸胶中该蛋白的 “表观/观察到的”分子量，是我们的最佳估算值。靶蛋白的“表观/观察到的”分子量与“预测”分子量不同、或者在使用者之间略有不同是常见的（例如，当使用不同浓度/成分的胶时）。
Q：抗体引用哪里看？
A：特定抗体的引用可在产品网页底部”Product Citations"部分中看到。您可以使用下拉菜单按应用或者物种筛选引文文献。
Q：抗原序列哪里查看？
A：用于生产CST抗体的抗原序列是CST专有的。但是，对于大多数产品，抗原的区域会在来源/纯化部分列出。如果您需要其他信息，请联系CST技术支持。联系电话：4006473287（免费服务热线）电子邮箱：info@cellsignal.cn（咨询）电子邮箱：tech@cellsignal.cn （技术支持）
Q：CST的抗体是否可以定制配方或者浓度？
A：对于定制（无载体）订单，PBS配方、不含BSA或者甘油的抗体均有库存。这种配方适用于偶联，并可与荧光素、珠子或者染料结合。为了满足您的检测方法或者实验室的需求，我们也非常乐意为您提供大包装。请联系我们了解价格和供应情况。
Q：CST是如何验证抗体的？
A：CST 抗体验证原则概览：https://www.cellsignal.cn/about-us/cst-antibody-validation-principles
Q：CST抗体如何储存？
A：CST抗体的储存条件见产品网页或说明书中“Storage”部分。我们的大部分非偶联抗体应储存于-20℃。因为CST大多数非偶联抗体是在甘油中的，抗体在此温度下不会冻住，因此我们不建议分装抗体，以避免移液过程中可能造成污染或者损失。有关特定产品存储建议的信息，请务必参阅产品网页或说明书。
Q：CST抗体如何分装？
A：CST的大多数抗体是在甘油中提供的，所以抗体在推荐的-20℃储存条件下不会冻住。因此，我们不建议分装抗体，移液过程中可能造成污染或者损失。有关特定产品是否分装的信息，请务必参阅产品网页或说明书。
Q：抗体批号在哪里查看？
A：抗体批号在抗体管子上。
Q：CST抗体生产日期在哪里？
A：抗体的参考日期（Ref）可在抗体管子上找到。该日期表示产品的灌装和包装日期（月和年），是效期的起点。
Q：“Best by”是什么意思？
A：产品管子上的“Best”日期表示产品效期的终点。只要在推荐的条件下储存，在此日期之前，产品表现预期能保持最佳。
Q：CST抗体浓度在哪里查？
A：抗体的最近批次的浓度可在产品COA中找到，产品CoA可在产品网页中下载。如果您有不同的批次或者未找到CoA，请联系CST技术支持获取。电子邮箱：tech@cellsignal.cn （技术支持）
Q：抗体的浓度比较低，我该怎么使用？
A：CST抗体是根据反应效果而非浓度配制的，目的是确保您的实验获得最佳效果。因此，我们可以确保抗体在网站或说明书中所述的应用和种属中，用我们推荐的实验步骤条件下可以工作。
Q：抗体的实验步骤在哪里看？
A：用于验证抗体和制作产品网页中结果图的实验步骤可在产品网页的“实验步骤”部分找到，可以通过下拉菜单选择特定的应用。产品网页中的步骤是针对该抗体的，所以在使用多个抗体时，需确认每种产品的实验步骤。
Q：CST产品的效期是多长？
A：CST产品效期网页：https://www.cellsignal.cn/learn-and-support/order-support-tech-support/product-shelf-life。当在推荐的条件下储存时，在效期内CST产品表现预期能保持最佳。
Q：CST产品的售后服务期限是多长？
A：如果产品在您的实验中表现不符合我们网站或说明书的描述，请在收到产品后12个月内联系您当地的CST办事处(技术支持)或代理商。
Q：发表文章时，需要知道CST产地，该如何写？
A：您可以这样引用CST产品：Cell Signaling Technology, Danvers, MA, USA
Q：发表文章时，需要标注抗体的RRID，如何查询?
A：CST抗体的RRID号可在 https://scicrunch.org 中查询。如您的某个抗体无法找到RRID号，请联系CST技术支持，我们将回复您。电子邮箱：tech@cellsignal.cn （技术支持）
Q：发表文章时，需要厂家的验证声明，CST的验证声明如何写？
A：We guarantee that our antibodies are fit for purpose by carefully tailoring the combination of validation strategies applied to each product. This means customizing our validation process according to the biological role of the target, while considering the sensitivity requirements of the downstream assay, the availability of appropriate testing models, and the relevance of each method to target investigation.
Q：WB实验时，为何要设置阳性对照？如何选择合适的阳性对照？
A：使用已知的阳性对照样品对于确保Western Blot实验正常工作是至关重要的。推荐的对照样本可见CST产品网页的结果图。CST还在���网页中https://www.cellsignal.cn/learn-and-support/control-treatments-by-target列出了针对我们许多产品的推荐对照样本。
Q：WB样本裂解时，为何要超声？如何超声？如果没有超声仪，有什么替代方法？
A：无论使用何种裂解液，CST始终建议采用超声处理来确保彻底裂解和蛋白质提取。超声处理对确保染色质和膜结合蛋白的有效提取至关重要。它也能起到剪切染色质的作用，染色质可能会干扰SDS-PAGE胶的电泳。
推荐在冰上用超声探头（15W 3×5秒脉冲)对裂解的样本进行超声，替代的方法有玻璃珠涡旋，或者用细针头（24G）反复抽吸。这有助于破碎残余的完整细胞器和DNA，增加蛋白的溶解量。超声处理后，样品可以离心（20,000 rcf(g) 10分钟）沉淀细胞碎片，取上清使用。
Q：CST抗体做WB，如何稀释？
A：CST抗体的稀释信息可在产品网页的实验步骤部分查看。
Q：WB实验，封闭和二抗稀释的条件是什么？
A：CST建议的封闭和二抗稀释条件可在产品网页的实验步骤部分查看。
Q：CST抗体是否可以做荧光Western?在操作时有何注意点？
A：虽然CST没有在荧光Western Blot中验证抗体，但CST抗体应能很好地在这一应用中使用。我们建议使用���我们的推荐步骤进行荧光Western Blot https://www.cellsignal.cn/learn-and-support/protocols/protocol-western-fluorescent。传统的Western Blot与荧光Western Blot的关键区别在于封闭缓冲液中不可含有Tween® 20。这是因为Tween® 20有自发荧光，并会增加非特异背景。封闭后的稀释液和洗涤缓冲液中可以含有Tween® 20。
Q：为什么我做WB时，CST不建议用我自己的实验步骤进行实验？
A：在CST，我们在产品开发的过程中会尝试多种步骤来确定特定抗体的最佳使用条件。产品网页中的实验步骤是CST发现可以使结果最优的步骤。与推荐方法的差异可能导致背景增加或者信号弱，导致实验失败。推荐实验步骤的改变会对Western Blot产生何种影响的具体案例可点击此处 https://www.cellsignal.cn/learn-and-support/protocols/protocol-western-variation。WB问题排查指南可点击此处。
Q：为什么我的条带分子量与说明书有偏差？
A：某些处理条件可能会改变蛋白的翻译后修饰，如磷酸化或泛素化，导致其分子量与CST网页或说明书中显示的分子量不同。此外，一些处理可能会导致蛋白剪切，导致不同大小分子量的出现。
还有许多实验条件可以导致蛋白质出现的位置与预期分子量不同。使用不同浓度或成分的凝胶可导致蛋白的位置与CST网页上所显示的出现不同。此外，合适的样品制备和储存对于避免蛋白降解至关重要，降解会导致蛋白剪切、拖带或多带，以及低信号或无信号的问题。
Q：为什么我的WB没有信号？
A：选择合适的样本对获得目的信号至关重要。很多靶标需要有特定的处理来诱导，使得它在细胞模型中表达，然后再通过WB观察。还有一些靶标仅在非常特定的细胞类型或组织中表达。因此，必须谨慎选择样本类型。
此外，一些抗体对某些封闭或稀释缓冲液敏感。CST建议遵循我们针对特定产品的推荐实验步骤来进行操作，以获得最佳结果。当在样品中没有观察到信号时，使用合适的阳性和阴性对照对于确定问题原因十分重要。
Q：CST可以提供哪些IP/Co-IP实验的相关产品？
A：1) 抗体：对于IP/Co-IP实验，推荐选择用于IP的抗体。如果客户要做Co-IP实验，并且提供了两个蛋白的名称蛋白X和蛋白Y，我们可以推荐既能用于IP实验，又能用于WB实验的抗体。使用X蛋白的抗体做IP，然后用Y蛋白的抗体做WB。同时，建议客户反向验证。
2) Beads：对于兔来源的抗体，推荐使用protein A偶联的beads，琼脂糖珠#9863，磁珠 #73778。磁珠无需离心，但需搭配磁力架（#14654 12-Tube Magnetic Separation Rack或者 #7017 6-Tube Magnetic Separation Rack）。对于小鼠来源的抗体，推荐使用protein G偶联的beads，琼脂糖珠#37478，或者磁珠#70024。
3) Isotype: IP实验中用到的isotype control 应该与一抗IgG亚型保持一致，由于兔只有一种IgG亚型，所以选择同型对照比较简单。对于兔多克隆抗体，我们推荐使用Normal Rabbit IgG #2729，对于兔单克隆抗体，我们推荐使用Rabbit (DA1E) mAb IgG XP® Isotype Control #3900。如果使用的是小鼠来源的抗体，在选择同型对照时相对来说更复杂。小鼠的同型对照有5种IgG亚型，IgG1, IgG2a, IgG2b, IgG2c, IgG3。CST抗体的具体亚型可以在产品网页“来源/亚型”中查看。CST提供如下小鼠同型对照：
Mouse (G3A1) mAb IgG1 Isotype Control #5415
Mouse (E5Y6Q) mAb IgG2a Isotype Control #61656
Mouse (E7Q5L) mAb IgG2b Isotype Control #53484
Mouse (E1D5H) mAb IgG3 Isotype Control #37988
Isotype的使用浓度应与抗体一致，并与IP样本进行平行实验。
4) 推荐用于IP实验的细胞裂解液：Cell Lysis Buffer (10X) #9803
5) 我们还提供进行Western blotting实验的相关产品，更多信息请参考本链接https://www.cellsignal.cn/applications/western-blot-immunoblot。
点击此处查看IP的实验步骤：https://www.cellsignal.cn/learn-and-support/protocols
Q：做IP的beads分为磁珠和琼脂糖珠两种，应该如何选择？
A：具体选择哪种beads取决于客户的习惯和实验室是否备有磁力架。
Q：IP实验，Beads选偶联Protein A还是G？
A：CST推荐对于兔来源的抗体使用Protein A beads，对于小鼠来源的抗体使用Protein G beads
Q：IP实验，抗体的同型对照如何选择？
A：IP实验中用到的isotype control 应该与一抗IgG亚型保持一致，由于兔只有一种IgG亚型，所以选择同型对照比较简单的。对于兔多克隆抗体，我们推荐使用Normal Rabbit IgG #2729 ，对于兔单克隆抗体，我们推荐使用Rabbit (DA1E) mAb IgG XP® Isotype Control #3900。当使用的抗体是小鼠来源的，选择同型对照更复杂。小鼠有5种IgG亚型，IgG1, IgG2a, IgG2b, IgG2c, IgG3。CST抗体的具体亚型可以在产品网页“来源/亚型”中查看。CST提供如下小鼠同型对照：
Mouse (G3A1) mAb IgG1 Isotype Control #5415
Mouse (E5Y6Q) mAb IgG2a Isotype Control #61656
Mouse (E7Q5L) mAb IgG2b Isotype Control #53484
Mouse (E1D5H) mAb IgG3 Isotype Control #37988
同型对照的使用浓度应与抗体一致，且与IP样本进行平行实验。
Q：CST提供的用于做IP的抗体是否可以用来做Co-IP？CST是否有相应的 protocol?
A：CST提供根据详细的实验方法验证的高质量的IP抗体，尽管CST不在内部例行进行Co-IP实验，但我们提供的通过IP验证的抗体适用于Co-IP实验。高特异性的抗体搭配经过全面验证的配套产品，包括IP微珠和试剂等可以确保可靠的IP和Co-IP数据，从而阐明蛋白质-蛋白质相互作用和蛋白质复合物的组成。
CST没有提供针对Co-IP的实验步骤，因为Co-IP实验需要根据所研究的具体的蛋白与蛋白之间的相互作用来优化实验条件。如果已知这两个蛋白有相互作用，进行Co-IP实验，我们建议参考文献。如果需要通过Co-IP的方法研究新的蛋白与蛋白之间的相互作用，建议以CST推荐的IP实验方法为起点，后面结合实验结果再进行优化。
Q：有适合Co-IP的裂解液吗？
A：#9803 Cell Lysis Buffer（10X）和＃9806 RIPA Buffer（10X）均可用于制备总的细胞裂解液进行Western blotting实验。但是，我们仅推荐使用#9803用于IP或Co-IP实验。RIPA缓冲液含有离子型脱氧胆酸钠，被视为较强的变性缓冲液。这种去污剂有助于破坏核膜并进一步溶解细胞核膜成分，同时可以防止蛋白质降解并且不干扰蛋白质的免疫反应性和生物学活性。但是这种缓冲液可以使激酶变性并阻止蛋白质-蛋白质相互作用。Co-IP实验可能很棘手，我们的内部经验非常有限。有许多因素会影响实验结果，例如相关蛋白质的相互作用强度，并且研究人员通常可能需要调整实验条件以获得最佳结果。实验人员可以以#9803 Cell Lysis Buffer搭配我们推荐进行IP实验的实验步骤为起点，着手进行Co-IP实验。请记住，使用上述两种裂解缓冲液时，超声处理至关重要，可以充分破碎细胞核和DNA，使蛋白尽可能的释放出来。超声处理在提取核蛋白和膜蛋白时尤其重要。
Q：进行IP实验的样本是否需要超声？超声是否会破坏蛋白与蛋白的相互作用？
A：Co-IP实验可能很棘手，我们的内部经验不多。有许多因素会影响实验结果，例如相关蛋白质的相互作用强度，并且研究人员通常可能需要调整实验条件以获得最佳结果。实验人员可以以#9803细胞裂解缓冲液搭配我们推荐进行IP实验的实验步骤为起点，着手进行Co-IP实验。请记住，使用上述两种裂解缓冲液时，超声处理至关重要，可以充分破碎细胞核和DNA，增加蛋白的得率。超声处理在提取核蛋白和膜蛋白时尤其重要。超声不会破坏绝大部分的蛋白与蛋白相互作用，在首次进行Co-IP实验时需要对样本进行超声处理。
Q：IP实验中抗体、样本和beads的孵育条件有什么要求？
A：CST抗体的孵育条件见产品网页的实验步骤部分。
Q：推荐的IP反应体积及蛋白浓度是多少？
A：对于大多数IP实验，我们推荐的细胞裂解液的用量为200ul，蛋白浓度为1mg/ml。这一浓度可能需要根据特定的目的蛋白进行调整。
Q：IP实验，Preclear这一步是否要做？
A：虽然预清洗不是必须的，但是通过beads预清洗，可以降低样本中蛋白与beads的任何非特异性结合。通过设置同型对照和只加beads（不加抗体）组，可以确保IP数据的准确性，排除由于靶蛋白与IP beads非特异性的结合造成的假阳性。
当选择使用什么beads时，很重要的一点是，理论上由于琼脂糖珠的多孔结构，琼脂糖珠比磁珠的结合载量更高。然而，由于磁珠更小、光滑且坚固，因此相同体积下它们可以提供相当的结合能力（相对于琼脂糖），使得抗体更好的接近目的蛋白和蛋白复合物，进而产生更高的产率和纯度。因为磁珠提供了更好的结合效率，所以预清洗磁珠并彻底清洗磁珠以减少背景/非特异性结合是重要的。
Q：IP实验中，推荐的抗体及beads添加顺序如何？
A：1. 将一抗（按产品说明书中建议的合适稀释比例）添加到 200 µl 细胞裂解物中，裂解液的浓度建议为1mg/ml。在 4°C 下旋转孵育过夜。我们建议在IP管中加入抗体，孵育过夜，让抗体更加有效的与目的蛋白相互作用，结合目的蛋白，然后通过珠子沉淀抗体和蛋白的复合物。
2. 加入protein A琼脂糖珠（10-30ul 50%的混悬液）。4°C旋转孵育1-3小时
3. 4°C离心30秒，使用1X细胞裂解液洗涤5次，每次500ul。洗涤间期，保持样品于冰上。
4. 使用免疫印迹法分析样本
Q：IP实验，推荐的抗体用量是多少？
A：抗体推荐的稀释比例可以在产品网页的“产品使用信息“部分和说明书中找到。
Q：在IP实验中，为什么我需要用IgG同型对照？
A：同型对照抗体是用来预估由于Fc受体结合或其他蛋白-蛋白相互作用所致的靶标一抗的非特异性结合。 IgG对照缺少抗体的特异性结合区域，但是，它与您的一抗类型匹配。在进行IP实验时，通常会设置两种不同的阴性对照：
1）beads对照。将珠子与裂解液一起孵育，不添加任何抗体。如果IP后的样本中有目的蛋白，表明目的蛋白与珠子有非特异性结合。
2）IgG对照。将裂解液、珠子与合适的IgG对照抗体而非靶标抗体一起孵育。如果IP后的样本中有目的蛋白，表明目的蛋白与抗体的IgG部分有非特异性结合。
对于兔单克隆抗体，建议使用 Rabbit (DA1E) mAb IgG XP Isotype Control (#3900)，对于兔多克隆抗体，建议使用Normal Rabbit IgG（#2729）。我们还提供了小鼠IgG1（#5415），IgG2a（#61656），IgG2b（#53484）和IgG3（#37988）的IgG对照。
当您使用IgG对照时，您需要将其浓度调整到与进行IP使用的一抗的浓度一致，以进行准确的比较。
Q：IP实验，推荐的阴性对照isotype用量是多少？
A：同型对照的用量应该与一抗的用量保持一致。
Q：IP实验，推荐的beads用量是多少？
A：对于Protein A Agarose Beads #9863 或者 Protein G Agarose Beads #37478，我们推荐每份样本中加入10～30ul的混悬液。
对于Protein A Magnetic Beads #73778 或者 Protein G Magnetic Beads #70024，我们推荐每份样本中加入20ul混悬液。请注意对于Protein A和Protein G磁珠，强烈建议进行预清洗来减少非特异性结合。需对足量的样本进行预清洗，来完成IP组和同型对照组。
Q：我用了你们偶联抗体的珠子进行IP，那么IgG组一定要用偶联了IgG的珠子吗？用普通的IgG可以吗？
A：考虑到IP抗体的用量与IgG的用量需要保持一致，如果使用beads偶联的抗体，最好使用同厂家提供的beads偶联的IgG作为阴性对照，这样加入相同体积即可保证抗体与IgG的加量一致。
Q：IP实验，为什么会出现抗体轻重链干扰问题？如何避免抗体轻重链的干扰？
A：由于加入了IP抗体，所以引入了IgG。在WB检测中加入了二抗。一般来说，二抗不但可以识别天然状态下的IgG，还可以识别变性的IgG。比如，用在IP实验的抗体是小鼠来源的IgG，在WB实验中用到了anti-mouse的抗体，那么在WB结果中可能会看到抗体的轻重链，轻链在25KD左右，重链在55KD左右，如果与目的蛋白的位置重合或者接近，会干扰检测结果。
解决的办法就是避免抗体识别到变性的IgG，或者不引入二抗，有以下解决方法：
1)进行WB时，选择只识别天然状态一抗的二抗
使用Light-Chain Specific或者heavy-chain specific的抗体
使用Conformation Specific antibody
使用protein A-HRP/protein G-HRP。protein A/protein G只识别天然状态IgG或者IgM。
2) 进行WB时，使用带有HRP标记的一抗，不再引入二抗。
3) 进行WB时，使用生物素偶联的一抗，不再通过抗原抗体亲和力来结合，而是通过生物素亲和素系统来结合。使用带有HRP偶联的亲和素识别生物素偶联的一抗。
4)将IP用的抗体固定在beads上，固定的方式有Direct immobilization of antibody和Crosslinking immobilized antibody两种方式。
即使使用不同物种来源的抗体分别进行IP和WB实验，也可能存在IgG重链和轻链干扰的风险，这是由于二抗与WB的其他物种的IgG的交叉反应引起的。建议使用已被其他物种预吸附的二抗或经验证具有高特异性的二抗。
Q：IP/Co-IP实验中western blot检测没有条带，请问如何排查问题，可能的原因有哪些？
A：应该设置一个总的细胞裂解液，以确保蛋白质印迹部分正常运行。如果在整个裂解液对照中看到目标信号，但在IP样品中未看到目标信号，则实验的IP部分可能失败了。可能的原因包括：
1.当靶蛋白处于其天然构象时，抗原区域被掩盖。因此，抗体将不会与靶蛋白相互作用，并且下拉失败。
2.清洗步骤和/或缓冲液太严格。这将导致蛋白质-抗体复合物在洗涤过程中从小珠上洗脱下来并丢失。为了测试这一点，可以将流穿液在SDS-PAGE凝胶上电泳，以查看是否可以检测到蛋白质-抗体复合物。
3.裂解缓冲液可能过强，在进行Co-IP之前，蛋白与蛋白的相互作用被破坏了。为了确认目的蛋白被拉下来，通过蛋白质印迹法分析结果时，应该同时检测目的蛋白及相关蛋白。
如果IP实验中用到的抗体的宿主与WB检测实验中二抗识别的物种不一样，也有可能存在抗体轻重链的问题。这是因为，举例来说，抗小鼠的二抗有可能非特异性识别兔来源的抗体。在进行WB实验时，尝试选择一个做过其他物种预吸附的抗体。
还有许多其他原因导致在IP中甚至在Co-IP中都检测不到信号。最好根据具体情况进行处理：
虽然我们建议蛋白A用于兔来源的抗体，蛋白G用于小鼠来源的抗体，但您仍然可以成功地将蛋白A或G用于小鼠或兔抗体。然而，您可能看到使用protein G富集兔来源的抗体时，信号较低，因为protein G与兔IgG的亲和力较低。同样的，您可能会发现使用protein A富集小鼠抗体的信号较低，因为protein A对小鼠IgG的亲和力低于Protein G对小鼠IgG的亲和力。预清洗对IP信号的减少影响极小，但是，我们注意到，由于未预清洗导致较高背景产生的问题比信号可能减少的情况要多。
Q：根据购买的Co-IP试剂盒步骤，先把抗体偶联在珠子上，再加入蛋白，发现没有IP下来，如何优化？
A：我们尚未使用该方法测试过我们的抗体，因此，我们无法评论。通常来说，IP/Co-IP实验结果没有信号可以从这些点进行排查（参见问题：IP/Co-IP实验中western blot检测没有条带，请问如何排查问题，可能的原因有哪些？）。
Q：CST 抗体做免疫荧光实验的步骤在哪里看？
A：验证抗体时和产品网页的结果图使用的IF实验步骤见产品网页-实验步骤部分。通过下拉菜单，选择IF。产品网页上的实验步骤是针对该抗体的，因此在使用多个抗体时，需确认每种产品的实验方案。
Q：CST抗体做细胞免疫荧光（IF-IC），如何稀释？
A：CST抗体的稀释信息可见产品网页中产品信息部分。详尽的稀释方法见产品网页的实验步骤部分。
Q：CST抗体能做石蜡切片免疫荧光实验吗？
A：在CST，我们在验证抗体时一般不使用FFPE样本结合荧光检测的方法。这是因为FFPE样本在处理过程中会导致高自发荧光，且蛋白损失也较大。这些原因会造成信号损失和表位遮蔽，所以，需要使用信号放大系统和复杂的光谱成像设备，而客户可能较难获得此类设备。关于哪些抗体可以用于FFPE样本，推荐化学显色法IHC的抗体可适用于FFPE样本。我们的IHC-P抗体验证方法是利用催化反应生成不溶产物的方法，因此我们建议用户使用类似的策略。为了模拟化学显色法IHC的条件，需要使用另一种信号放大方法（如酪胺放大）。CST设计了一套多色IHC实验步骤，可能对您有所助益。还有一种可能，如果靶标丰度高，比如H2A.X，样本中保留了足够多的信号，那您可以使用间接免疫荧光法检测样本。以上方法均取决于样本、靶标，并且具体条件需要进行优化。如您想尝试该方法，建议您遵循IHC实验步骤的A-C部分，然后进行IF步骤的C部分，实验步骤可见产品网页。
Q：免疫荧光实验中，为什么我发现你们结果图中荧光素的颜色和一般认为的不符？
A：大多数成像系统以灰度形式捕获荧光发射光，并使用查询表（look-up tabel, LUT)来赋予符合染料发射光峰值的色彩。例如，DAPI传统上是蓝色的，因为它是一种可被紫外激发的蓝色染料。基于DAPI光谱，它的可见光范围可以从紫色一直到绿色。有时我们觉得，为了让靶蛋白有更好的可视性，我们就没有使用LUT色彩。例如，Alexa 555发黄光，但我们经常选择将其显示为红色，因为这会使它在DAPI(蓝色)和Alexa 488(绿色)中有明显的对比。当我们以非标准的方式展示结果时(例如，DAPI为红色)，我们在图注中会注明“伪彩”。
Q：如何下载ChIP或CUT&RUN中文版操作步骤？
A：1) 前往cellsignal.cn， 在“产品”搜索框中输入产品货号（例如9002S）, 然后按Enter。2）选择说明书；3）从菜单（Mac和PC）中选择“打印”；或4）选择“导出为PDF”；5）用您喜欢的短名保存。
Q：CST的ChIP试剂盒（9002S，9003S，9004S，9005S，56383S）有什么区别？如何选择？
A：1） #9002和#9004是琼脂糖珠试剂盒，适合做ChIP-qPCR实验，不推荐做ChIP-Seq。#9003和#9005是磁珠试剂盒，既适合做ChIP-qPCR实验，又适合做ChIP-Seq。
2）相比#9002和#9003，#9004和#9005附有适合组织ChIP的操作步骤和试剂(价格也高一些)。
Q：ChIP或CUT&RUN的部分组分用完了，可以单独购买吗？
A：很多ChIP和C&R试剂盒里的试剂都有独立或组合售卖。若需要某试剂，请联系基因公司相关人员。
Q：ChIP实验，是否一定需要用无甲醇的甲醛固定细胞？
A：虽然很多人会顾虑甲醇对细胞的伤害，但在内部测试中，用含甲醇的甲醛与不含甲醇的甲醛进行ChIP实验，结果没有差异。故而我们内部测试时使用含甲醇的甲醛。另外，含甲醇的甲醛更稳定且经济。无甲醇的甲醛，我们推荐CST#12606，如果是含甲醇的甲醛，我们推荐Sigma F8775。使用前请确保甲醛未过期。
Q：ChIP实验，我可以用多聚甲醛固定吗？
A：PFA不是交联剂，如果用PFA做固定会导致实验失败。
Q：ChIP实验，超声操作方案中什么样的超声仪器最好用？
A：有三种主要的超声仪类型：探头式（接触式）、封闭震荡式 Biorupter（非接触式）、水浴式（非接触式）。根据诸多用户的反馈，Biorupter 相对来说最不适合做 ChIP 超声，因其 DNA 片段化效率低，长时间超声可能导致蛋白被破坏。探头式超声仪最便宜，而且 DNA 片段化效率高，相对推荐。水浴式（如 Covaris）片段化效率高，且最稳定重复性好，易于优化实验，最为推荐。
Q：ChIP实验中，（超声法）我为什么超声很久，片段大小仍然没变化？
A：一般来说，过度交联可以导致染色质片段化出现问题，特别是在超声ChIP的过程中。我们一般建议用1%甲醛交联10分钟来处理培养细胞，不论靶标是什么。如果是组织样本，检测转录因子和辅因子，交联时间可延长至30分钟。另外一种可能是超声时细胞密度太高，我们建议细胞不超过20M/ml。如果超声细胞少于20M，可考虑缩小超声缓冲液的比例，以确保染色质样品的浓度恰当。
Q：ChIP实验，酶解法为什么还需要超声？
A：超声的目的在于破坏细胞膜和核膜，因为消化后的染色质仍在通透后的核内，所以需要使核内染色质释放到上清液中。超声时的缓冲液为1xChIP Buffer，该Buffer不是超声buffer，不会使染色质片段化。
Q：ChIP实验，（酶解法）每一步 buffer A和buffer B的作用？
A：1) 收集到的细胞用buffer A重悬，buffer A是细胞膜核膜 “打孔剂” ，以便核酸酶进入细胞核
2) 离心收集细胞核沉淀，用buffer B重悬（第一次） ，洗去残余的buffer A
3) 离心收集细胞核，用buffer B 重悬（第二次） ，提供最佳酶消化体系
Q：ChIP实验，（酶解法）超声的步骤是什么？我没有超声仪怎么办？
A：短暂超声处理 (20秒, 3次, 每次大于30秒间隔)，替代方法：Dounce匀浆器处理 20次，但破碎效果可能不完全。
Q：ChIP实验，酶解法酶的用量怎样根据细胞用量调整？
A：我们建议每400万细胞用0.5ul MNase，依照百万细胞增加或减少Mnase量。根据我们多年ChIP经验，这个比例适用于多种细胞系。如果您的细胞计数有系统性误差，可以参考ChIP步骤中附录A的流程优化，以确定每400万细胞的酶量（足够一次IP）。
Q：ChIP实验，对于转录因子和辅因子的ChIP，酶解法是否适用？
A：基于我们的实验经验，对于转录因子和辅因子，酶解法ChIP优于超声法。因为转录因子和辅因子的DNA结合能力相对较弱（相对于组蛋白），而超声法可能导致蛋白-DNA解离，甚至是DNA的降解，转录因子和辅因子的IP损失会导致结果假阴性。相比而言，酶解法就没有以上问题，所以能在转录因子/辅因子中产生可重复的较高的ChIP信号。
Q：IP 级别的抗体能否用于 ChIP 实验？
A：ChIP 实验对抗体的要求高于 IP 实验。若使用未经过 ChIP 实验验证的 IP 级抗体进行 ChIP 实验，可能有低信号或高背景的问题。对于ChIP后的测序分析，是检测全基因组范围内的结合作用，因而需要更高级别的ChIP-seq抗体。可参考产品说明书。
Q：ChIP的抗体用量是什么？
A：对于ChIP/ChIP-seq抗体，CST都会验证最佳稀释比，比如，抗体稀释度1:100的意思是，在500ul、含有10ug染色质的ChIP反应体系中加5ul抗体。注意：抗体与染色质的比例在ChIP实验中非常关键，抗体的量需根据DNA的量调节，而非ChIP反应的体积。
Q：ChIP试剂盒中只有ProteinG的珠子，兔抗鼠抗都能用吗？
A：是的，protein G对兔、鼠、山羊IgG具有高亲和力。所以，我们的ChIP试剂盒（含proteinG 珠子）可以用于多种种属的商品化抗体。
Q：ChIP 洗脱和解交联这两步都是65度进行的，可以合并步骤吗？
A：不建议将这两步合并。ChIP 洗脱过程中，抗体-染色质复合物会从 Protein G 微珠上洗脱下来，这步在恒温振荡混匀仪（Thermomixer）中以 1,200rpm 左右转速进行，较为剧烈。如果蛋白酶 K 在此时加入，原本共价偶联在微珠上的 Protein G 会被蛋白酶 K 消化，进而相应的降低蛋白酶 K 对抗体-染色质复合物的消化效率。同时，Protein G 上非特异结合的 DNA 也可能被更多的洗脱在溶液中，造成可能的背景信号升高。
Q：ChIP实验，我得到结果信号很低，为什么？
A：1) 抗体用量是否合适？
2) 抗体是否已经验证过能做ChIP？
3) 染色质用量是否合适？一般建议：
Histone (PTM): 2.5-5 ug
TF: 5-8 ug
Cofactor: 10 ug
4) 染色质质量如何？片段大小是否集中在150-500bp?
Q：ChIP实验，我得到结果IgG背景很高，为什么？
A：1) 洗涤不充分
2) IgG的用量是否不合适？（与一抗等量）
3) 阴性位点选取是否合适？
4) PCR体系是否污染？
5) 引物特异性问题
6) 常规PCR循环数是否过度？
7) qPCR计算方法是否合适？
Q：ChIP-seq 与 ChIP-qPCR 检测方法如何选择？
A：ChIP-seq 关注的是基因组或者染色体组上的整体信息，而 qPCR 关注某些基因位点的特定信息，在做昂贵的 ChIP-seq 之前，往往需要先用 qPCR 对ChIP-DNA样本进行质控。
Q：ChIP实验，如果通过qPCR的方法检测实验结果，如何做标准曲线，判断扩增效率？
A：连续稀释用于qPCR反应的2％ input染色质DNA（未稀释，1：5、1：25、1：125）。使用Log10（％Input）作为X轴,Ct值作为Y轴绘制标准曲线。PCR效率=（10 ^（-1 /斜率）-1）* 100％。我们预计PCR效率在85％-115％之间。
Q：消化的染色质浓度过低（低染色质产率）
A：可能是添加到染色质消化的组织或细胞不足或者细胞核在消化后未完全裂解。建议在每次IP添加额外染色质，达到至少5ug/IP的水平，然后继续操作流程。或者在交联前对组织称重或对单独的细胞板计数以测定准确的细胞数目。某些组织每次IP可能需要处理25mg以上。组织含量可增加至每次IP 50mg，而仍保持高效的染色质片段化和提取。增加染色质消化之后超声处理的次数。在超声处理前后在显微镜下观察细胞核以确认细胞核的完全裂解。
Q：染色质消化不足且片段过大（多于900个碱基对）。染色质片段较大导致本底增加和分辨率降低？
A：可能是在染色质消化中添加的细胞过多或微球菌核酸酶不足。建议在交联前对组织称重或对单独的细胞板计数以确定准确的细胞数目。在染色质消化中添加更少组织或细胞，或更多微球菌核酸酶。
Q：酶解后未纯化/纯化后，染色质浓度已经极低（ChIP前），如何优化？（细胞已经用足量）
A：染色质DNA的浓度低提示了染色质抽提失败，染色质浓度低是由于细胞活力不够或染色质制备中有实验错误。我们建议不要用浓度过低的染色质DNA做ChIP实验，联系CST技术支持做问题排查。
Q：ChIP实验，选择琼脂糖珠还是磁珠？
A：磁珠的优点是在洗涤步骤中无需离心，这样可以减少时间，减少吸出磁珠的机会。磁珠做IP结果通常也具有较低的背景。此外，磁珠试剂盒（货号#9003、#9005和#56383）与ChIP-seq兼容，而包裹在琼脂糖珠上的精子DNA（用于减少非特异性结合）可能会污染您的ChIP-seq样品。因此，如果要进行ChIP-PCR，则磁珠或琼脂糖珠都可以。但是，如果您要进行ChIP-seq，我们仅建议您使用磁珠。需要使用磁力架来沉淀磁珠，您可以在我们的网站上购买（货号＃7017或#14654）。
Q：CUT&RUN抗体如何选择？
A：我们推荐先用经过C&R验证的抗体，然后可考虑仅ChIP或ChIP-seq验证的抗体。然而，我们发现并非所有仅ChIP-seq验证的抗体都能用于C&R。此外，Peter J. Skene et al. (2017; PMID28079019) 建议尝试经过IF方法验证的抗体，因为CUT&RUN中，抗体的结合发生在核完整的环境下，这类似于荧光实验。
Q：CUT&RUN实验中，Digitonin的作用？
A：Digitonin渗透细胞膜并提取胆固醇。与质膜相比，缺乏甾醇的膜(如核膜)受Digitonin的影响很小。因此，用Digitonin处理细胞是一种在不损害细胞核完整性的情况下通透细胞的有效方法。它有助于防止实验过程中非特异性大染色质DNA从细胞核中释放出来，从而确保较低的背景信号。
Q：CUT&RUN实验中，Digitonin反复高温加热有没有影响？使用时需要溶解完全什么样子？可以分装吗？
A：CST内部测试过延长Digitonin加热时间，对实验没有明显影响。因此相对于加热，更担心的是不完全溶解造成样本通透不足。每步使用前，都需要确认它已经彻底溶解。溶解完全时液体为无色透明状态，没有颗粒物。如果客户需要分装的话，需要注意分装会造成量的损失（枪头，管壁），避免不够24个反应的用量。
Q：CUT&RUN实验中，pAG-MNase的用量是否需要根据抗体的用量调整？
A：目前我们都是用ChIP的推荐稀释比例来做C&R实验的，我们的内部测试结果提示抗体稀释比不会显著影响实验结果。不管抗体量如何，无需调整酶的使用量。我们CUT&RUN优化后的消化条件在多种细胞系中都能工作，包括贴壁和悬浮细胞。此外，当增加或减少pAG-MNase的加入量和消化时间时，我们没有观察到染色质消化有显著变化。这一观察与Peter Skene et al. (2018; PMID29651053)一致。
Q：CUT&RUN得到的DNA 片段大小？
A：对于组蛋白修饰一般150bp,转录因子80bp,所以设计qPCR引物的时候要注意PCR产物长度。
Q：CUT&RUN 与 ChIP-seq 建库、测序以及分析方法是否完全一样，只是reads减少吗？
A：CUT&RUN 和ChIP（酶解、超声）得到的DNA的片段化长度和产量是不一样的，因此拿到DNA之后建库的时候也要做针对性的优化。具体参考官网说明书VII。两者测序后分析方法类似。Reads数取决于测序深度，而非方法本身。
Q：CUT&RUN 可以用于动物组织吗？冻存的组织可以吗？
A：是的，我们的CUT&RUN Assay Kit已使用组织样本验证（见说明书）。我们建议在冰冻前对组织进行适当固定。在我们的测试中，对于未固定的冰冻样本，组蛋白靶标效果是可以的，但非组蛋白类靶标具有相当挑战性。
Q：CUT&RUN 实验，Input组细胞不能用CST提供的柱子纯化吗？
A：这取决于Input gDNA有没有被片段化过。CST目前的ChIP和C&R纯化柱适合于10kb以下片段。如果Input样品经过超声或者酶解片段化处理，则可以使用CST柱子纯化。如果Input gDNA为完整的基因组，应该使用大片段的纯化方法（比如gDNA柱纯化和苯酚氯仿纯化）。
Q：对于CUT&RUN实验中的阳参和阴性对照中input%，是否有像ChIP试剂盒那样推荐的范围？
A：目前CUT&RUN的经验还不如ChIP充足，但我们基本上参考ChIP的标准。在CUT&RUN中，IgG背景可能比ChIP里会高一点，不过和阳性对照比，信号倍数至少3倍以上。
Q：CUT&RUN 测定法在用于分析转录因子和辅因子结合、DNA 复制因子和 DNA 修复蛋白的结合时的注意事项，动植物细胞的实验处理区别和特别要注意的地方？
A：CUT&RUN用于不同靶蛋白，会有产物DNA片段大小和DNA得率的区别。目前从CST的经验来看转录因子类富集的片段大小峰值在80-100bp左右，产量1个反应0.5-10ng。组蛋白修饰富集片段大小峰值在100-150bp左右，产量1个反应1-20ng。根据片段大小和产量可以适当参考选择纯化方法、PCR分析的引物扩增子、DNA测序文库构建的温度设置，详见说明书。对哺乳动物细胞样本，参考说明书即可。如果是植物样本，可以参考文献：Zheng, X-Y, . et al. (2019) Plant Reprod, 32(1):63-75.
Q：CUT&RUN 实验，阳性对照只能选择H3K4me3吗？
A：Total Histone H3 在CUT&RUN反应中表现不佳。这点得到CST内部验证和Henikoff实验室的双重确认,因此我们不建议选择Histone H3作对照。和ChIP不一样，在CUT&RUN中我们没有一个针对任何引物都适用的真正意义上的阳性对照抗体。因而，我们选择了一个最容易操作成功率最高的组蛋白修饰H3K4me3并且配备了相应的阳性对照引物。其在全基因组内的结合区域，有阴性和阳性的区域，更方面测序时在整个基因组内观察计算信噪比。如果选用其它组蛋白修饰抗体作为实验对照（如H3K27me3或者H3K36me等等），需要自行考虑以下两个因素：1，要自行设计针对此阳性对照抗体的阳性引物（每种不同修饰组蛋白其DNA结合位点不同）；2，要考虑这个抗体是否在CUT&RUN中得到验证并持续稳定产生强信号。
Q：CUT&RUN 与CUT&Tag对比：
A：当使用100K细胞时，C&R和C&T用组蛋白抗体在全基因组中可产生相当的信号。然而，C&T在检测转录因子和辅因子时并不能很好工作。
Q：CUT&RUN qPCR信号低，为了排除蛋白从染色质掉落，是否可以先用甲醛将细胞固定，再进行CUT&RUN的步骤？
A：我们目前的CUT&RUN步骤在活细胞的辅因子（松散或间接结合DNA）中效果良好。请在网页中查看辅因子的C&R数据实例，如RING1B和Bmi1。需要注意，对于转录因子/辅因子，4℃消化（冰箱中）通常比在0℃消化（冰上）产生更强的信号。固定可能对蛋白复合物中的附属成分（如JARID2）有所助益，但对核心成分（如SUZ12）没有助益，具体可以参见#86652说明书中的Figure 6。在大多数情况下，活细胞比固定细胞有更高的信噪比。
Q: MN Nucleobond 质粒抽提产品得到的质粒有类似于颗粒状沉淀物，为什么？
A: 如果您使用MN Nucleobond 质粒抽提产品得到的质粒有类似于颗粒状沉淀物，如图片所示。一般是由于异丙醇沉淀过程中，异丙醇和ELU溶液加入顺序错误。要异丙醇加入ELU质粒粗体液内。
Q：如何提高抽取质粒中质粒的超螺旋？
A: 1.菌株，大肠杆菌宿主菌株对质粒DNA的质量影响很大。像DH5α®或XL1 Blue这样的菌株通常产生高质量的超螺旋质粒DNA，其他菌株，例如具有高水平核酸内切酶活性的HB101，可能产生较低质量的质粒，从而在酶限制或测序等下游应用中产生较差的结果。
2.溶液的PH值，但是MN的试剂盒里面的试剂的组份都是优化过的
3.裂解步骤，裂解液加入后颠倒要温柔，且裂解孵育时间不要超过5min
4.使用finallizer时，使用的力度不要太大，保持液体持续成滴滴下
5.建议使用经典离心法来代替finallizer
Q：一直用的很好，近期MNG质粒提取得率低是为什么？
A: 排除掉试剂贮藏温度后，可能是外界温度低造成了LYS SDS析出，裂解能力下降。建议37度水浴15min。
Q:使用MN/740548提取的质粒有白色沉淀析出，如何解决？
A: 方法一：.室温放置一段时间，10-30min,可37℃温浴
方法二：如果沉淀不溶解，按照如下操作：
1. centrifuge the sample for 1min（样品离心1分钟）
2. the particles will be on the ground afterwards（颗粒会沉淀在底部）
3. transfer the supernatant into a new tube（将上清液转移到新试管中）
Q: MN Nucleobond 质粒抽提产品得到的质粒有基因组污染怎么办？
A: 基因组污染通常是由于裂解过程和操作过于剧烈导致的。您可以注意以下步骤：
1.裂解：在菌悬液中加入裂解缓冲液LYS时，将试管翻转5次，轻轻混合，不要旋涡，过大的力度会造成基因组DNA污染。在室温(18-25°C)下孵育5分钟即可，孵育时间注意不要超过5分钟。
2.中和：在悬浮液中加入中和Buffer NEU，立即混合裂解液轻轻地倒置试管，直到蓝色样品完全无色! 但同样不要漩涡。
Q:MN胶回收产品怎么用？
A：需要根据胶的浓度的重量进行溶解Buffer的添加，如下图：
Q：MN胶回收可以做RNA回收吗？
A:可以，但是需要购买Buffer NTC和盒子一起使用。
Q：使用MN Nucleobond 质粒抽提产品得率低，是为什么？
A : 情况一：质粒没有繁殖
•检查澄清的裂解物中的质粒含量。使用新鲜平板中的菌落进行接种，并向平板和培养基中添加新鲜的选择性抗生素。
情况二：裂解效率低下
• 细胞加入量过大。关于推荐的培养物体积和裂解缓冲液体积，请参阅产品说明书。
• 使用前，检查缓冲液LYS溶液的SDS沉淀情况（特别是在经过低于20°C的储存后）；如有必要，将瓶子在30–40°C下孵育几分钟，并充分混合，直到SDS再次溶解。
情况三：样品中存在SDS或其他沉淀物
• 将粗裂解物加到NucleoBond®Xtra柱滤器上并插入NucleoBond®Xtra柱中。这确保了SDS沉淀物的完全去除。
• 将澄清的裂解物放置较长时间可能会形成新的沉淀物。如果可见沉淀物，建议在将裂解物装载到NucleoBond®Xtra柱上之前，直接再次过滤和离心裂解物。
情况四：样品/裂解物太粘稠
• 细胞加入量过大。关于推荐的培养物体积和裂解缓冲液体积，请参阅产品说明书。
• 确保中和后充分混合，使SDS和染色体DNA完全沉淀。否则，过滤效率和流速下降，SDS会阻止DNA与柱结合。
情况五：缓冲液的pH或盐浓度过高
•检查清洗流穿液中的质粒含量。确认所有缓冲buffer密封保存。如有必要，用HCl或NaOH检查并调整缓冲液EQU（pH 6.5）、WASH（pH 7.0）和ELU（pH 9.0）的pH。
Q: 如何选择合适的一抗？
A: 请先确定您要检测的种属和使用的实验方法，然后查找相关产品，根据说明书上描述的“适用种属和实验方法”来确定合适的抗体。如果说明书中有明确您要检测的种属和实验方法均经过检测，则您可以放心地购买该产品。
Q: 如何选择合适的二抗？
A: 二抗的选择原则：
* 针对一抗来源的二抗（比如一抗是小鼠来源的，二抗就要是抗小鼠的）
* 针对一抗Ig亚型的（比如一抗是IgM，二抗就要是抗IgM的抗体）
* 为了增加特异性、降低背景：可以选择Fab段的抗体（去除Fc段的）、经过标本来源种属血清吸附的的二抗
* 查看二抗的说明书，选择经过验证可以用于相应实验方法的二抗
Q: 如何选择同型对照？
A: 同型对照的主要目的是确定一抗的结合是特异性的，而不是非特异性的Fc受体或与其他蛋白的相互作用。同型对照要与一抗的来源、Ig分型和标记完全一致。例如：一抗是FITC标记，其抗体分型是小鼠的IgG1，则同型对照要选择是FITC标记的小鼠的IgG1。
Q: 如何选择阳性对照？
A: 阳性对照的使用是一个实验中确定抗体及检测系统是否正常工作的依据，也是确定待测标本中是否存在待测蛋白的一个依据！尤其是检测的标本是不确定是否有待测蛋白表达时。因此当实验没有阳性结果出现时，最好的选择是实验合适的阳性对照
大部分抗体的说明书上都有推荐的阳性对照。但是如果说明书上没有推荐时，请参考以下条款：
* 看看说明书中是否有Abreviews。任何被其他客户成功检测的组织、细胞或者裂解物均可以作为合适的阳性对照！
* 根据说明书上的Swiss-Prot 或 Omnigene 数据库来查找。这些数据库经常会列出该蛋白表达的组织，这也可以作为合适的阳性对照！
* 查查该蛋白的GeneCards 吧，这里通常会有蛋白在不同组织的表达水平。
* 如果上述方法还是不能找到合适的阳性对照，推荐您去PubMed 查查发表文章，看看有无文章报道该蛋白表达的细胞和组织。
Q: 如何确定一抗的稀释比例？
A: 如果说明书中有推荐的稀释比例，请按照该稀释比例进行实验。但是由于标本类型、实验条件、操作环境等各种因素的影响，推荐浓度仅作为参考。实验者需要在推荐浓度周围进行多个浓度梯度的实验，从中发现最佳的稀释比例。
如果说明书没有推荐稀释比例，仅注明“Use at an assay dependent dilution”，就需要做大量的预实验来摸索最佳的比例了。下表列出的纯化抗体抗体用于不同实验方法时常用的工作浓度，可以作为预实验的参考。未纯化的抗体一般在说明书中不会标明抗体的浓度，因为大部分全抗血清、培养上清或腹水形式的产品浓度都是没有经过测定的。如果未纯化抗体产品的说明书中没有标明其中特异性抗体的浓度，实验者可以参考下表中“估计浓度”确定各种实验稀释比例。
请记住，下表中的各种稀释比例和工作浓度仅仅是作为一个起始点，需要根据试验结果来进行适当的调整。最好以此起点作一系列的浓度，从中确定最佳的工作浓度和稀释比例！
组织培养上清 | 腹水 | 全抗血清 | 纯化抗体 | |
WB / dot blot | 1/100 | 1/1000 | 1/500 | 1 ug/ml |
IHC / ICC | neat - 1/10 | 1/100 | 1/50 - 1/100 | 5 ug/ml |
EIA / ELISA | 1/1000 | 1/10000 | 1/5000 | 0.1 ug/ml |
FC | 1/100 | 1/1000 | 1/500 | 1 ug/ml |
IP | 1/100 | 1/50-1/100 | 1 - 10 ug/ml | |
Concentration estimate | 1 - 3 mg/ml | 5 - 10 mg/ml | 1 - 10 mg/ml |
Q: 如何确定适用于某种特定抗体的抗原修复方法？
A: 有些抗体对抗原修复方式有特别要求的，一般在其说明书中都会有明确的标注和推荐。但是很多抗体并没有一个特别的推荐，就需要实验者自己来进行优化和摸索了。
Q: 为何实际检测到的WB条带与预期的有所区别？
A: WB是根据蛋白质的大小来分离蛋白的，通常小分子量蛋白在凝胶中的迁移速度要快。但是迁移率也是受到其他因素影响的，这就造成了实际检测到的条带与预期条带的不一致。主要有以下几种常见因素：
* 翻译后修饰－比如磷酸化、糖基化等，这些修饰会增加蛋白质的分子量
* 翻译后剪切－比如很多蛋白是以前体蛋白的形式合成的，在执行功能时需要进行剪切成活化的形式，如pro-caspases
* 不同剪切体－有些来源于同一基因的蛋白有不同的剪切方式，每个剪切方式得到的蛋白大小都是不同的
* 相对电荷（Relative charge）－氨基酸的组成(charged vs non-charged)
* 多聚体－如二聚体或三聚体。这些多聚体的形式通常会抵制WB时所做的还原条件，因此造成检测的条带偏大
Q： LI-COR荧光二抗如何选择？
A：首先确定您的一抗来源，若一抗来源于Mouse，二抗选择“anti-Mouse”，如Goat/Monkey anti-Mouse。单通道检测，首选800通道荧光二抗，背景比700通道更低。目的蛋白和内参蛋白双通道同时检测，建议目的蛋白选用800通道的荧光二抗，内参蛋白选择700通道的荧光二抗，若您使用REVERT总蛋白染色试剂盒进行均一化，目的蛋白选择800通道的荧光二抗。
Q：LI-COR二抗说明书如何下载？
A：厂家官网输入产品货号www.licor.com/bio/cn/，进去产品界面，货号右下方的Pack insert 即是产品说明书。
Q：700通道RD 和LT 这两种二抗有什么区别，哪个更好？
A：RD最常用，背景低，应用广，首选二抗。LT亮度高，背景高，应用少，次选。
Q：LI-COR荧光二抗怎么复溶？复溶后浓度是多少？使用时推荐用什么稀释？
A：首次打开盖子前离心（10000r/min以上），加入无菌蒸馏水至抗体浓度为1.0 mg/mL（如0.5mg加500μl）。轻轻反复倒置，室温静置半小时保证充分溶解。按照实验安排合理分装，近期使用的二抗4℃避光保存，其余二抗-20℃避光保存，避免反复冻融。
使用时，建议用抗体稀释液或封闭液+Tween 20（终浓度为0.2%）稀释至最终使用浓度。
Q：LI-COR荧光二抗可以用多少次实验？
A：0.5mg规格的二抗稀释后体积是500ul，按照效价1：20000计算，一张杂交膜大概需要5-10ml抗体反应液，每5-10ml的抗体反应液需要加入0.25-0.5ul二抗，这样算下来，可以做1000-2000次反应。0.1mg规格的二抗可以做200-400次反应。具体稀释比例可能需实验优化。
Q：LI-COR荧光二抗储存条件是什么？
A：避光储存，粉末状4℃保存，用无菌蒸馏水溶解成母液后-20℃或-80℃避光储存。
Q：LI-COR荧光二抗可以储存多长时间？
A：冻干粉状态4℃储存，注意避光防潮，保质期为3个月。建议置于-20℃或-80℃，可延长保存时间。用无菌蒸馏水溶解成母液后-20℃或-80℃避光储存可长达2-3年。
Q：LI-COR荧光二抗的激发跟发射波长是多少nm？
A：IRDye 800CW 的二抗激发光波长是778nm，发射光波长是794nm;
IRDye 680RD/LT 的二抗激发光波长是680nm，发射光波长是694nm
Q：除了lgG亚型的荧光二抗，还有其他亚型的么？
A：700通道有羊抗鼠的IgM亚型二抗；800通道的有羊抗鼠的IgG1、IgG2a、IgG2b、和IgM亚型的二抗。
Q：lgG亚型的荧光二抗，重链和轻链都可以检测出来么？
A：H链和L链都可以检测。
Q：LI-COR荧光二抗可以回收么？
A：不建议回收。
Q：LI-COR二抗对应的颜色是什么？
A：软件默认700通道二抗显示的条带是红色（货号：925-680XX或926-680XX），800通道二抗显示的条带是绿色（货号：925-322XX或926-322XX）。
Q：LI-COR二抗能不能剥离（Stripping）后重新孵育抗体？
A：Western Blot实验不建议剥离后再次孵育抗体，因为剥离过强或过弱都可能造成假阴性或假阳性，影响结果的准确性。如果实验需要，LI-COR提供NewBlot IR 剥离缓冲液（P/N: 928-40028），不收危险品费，适用于去除NC膜和PVDF膜上的所有IRDye二抗。
Q：700通道和800通道同时显色检测时，对一抗有什么要求？
A：确保两个一抗的来源不一样，如一个选择来源于小鼠的，另一个选择来源于兔的一抗。
Q：700通道和800通道同时显色检测时，两个LI-COR荧光二抗可以同时孵育么？
A：确保两个一抗的来源不一样的条件下，可以同时孵育。
Q：LI-COR 的封闭液只能用于荧光WB么？
A：同样适用于化学发光。
Q：Protein-Free的封闭液跟常规的有什么区别?
A：不含蛋白质，适合于不能包含动物蛋白系统的实验中。
Q：LI-COR 封闭的时候需要避光么？
A：不需要。
Q：LI-COR 封闭液储存条件？
A：4℃储存。
Q：LI-COR的封闭液为啥能降低背景，比常用的脱脂奶粉、BSA好在哪里？
A：目前市面上大部分抗体都是小鼠，兔子，山羊等哺乳动物来源，这款封闭液不含哺乳动物蛋白质，可以极大限度的降低与哺乳动物来源的抗体的交叉反应，封闭效果是脱脂奶粉或者BSA所无法比拟的，尤其是在磷酸化检测或者有生物素的检测系统中。
Q：LI-COR 封闭液效期是多久？
A：一年左右，包装瓶上印有效期。
Q：LI-COR 封闭液可以直接使用么？
A：开盖即用型，不需要稀释或其他处理。
Q：LI-COR PBS和TBS哪一款封闭效果更好呢？
A：如果您进行磷酸化检测，TBS 更加适合；如果不是，看您以往使用习惯和使用效果，以及您的一抗要求的缓冲体系。
Q：LI-COR PBS和TBS两款封闭液有什么区别？
A：基础缓冲液成分不一样，TBS封闭液使用的是Tris盐酸缓冲液，PBS封闭液使用的是磷酸盐缓冲液。
Q：REVERT总蛋白染色试剂盒除了染料还包括哪些成分？可以做多少个反应？
A：926-11015 REVERT 试剂盒包含染色液和洗液，可以染20张杂交膜。
Q：REVERT 700染色后需700nm 还是800nm进行检测?
A：700nm
Q：孵育一抗前，需要洗掉REVERT染色液吗？
A：一个指标的检测时不需要洗掉染色液，直接可进行封闭，一抗和800通道二抗的孵育；双色成像时需要将染液洗去后再进行封闭和两个抗体的孵育。
Q: NEB限制性内切酶进行DNA酶切时，酶切失败或酶切不完全的原因及解决办法有哪些？
A: 1. 酶失活，酶应贮存在-20℃，-70℃贮存会冻结，另外反复冻融会降低酶活性。通常可用已知多位点对照DNA测试该酶活性。
2. 反应条件未优化，通常应按照推荐方法用限制性内切酶推荐缓冲液进行双酶切或分步酶切（均经过试验验证确认方法是优化的）。
3. 酶浓度过低，某些质粒或基因组DNA需要的酶量在10-20单位/ug。
4. 添加物缺失，解决的办法是重复操作，确保加入的酶或/和添加物（如BSA）
5. DNA浓度不适，NEB推荐50ul反应体系使用1ug DNA，过量DNA会导致酶切不完全。
6. 温育时间过短，某些酶对特定的位点切割速率较慢，绝大多数情况下1-2小时最够了。
7. DNA被抑制剂污染，将底物DNA与对照DNA一起消化，如果存在抑制剂，则对照DNA不会被切割，销量制备的DNA对抑制剂尤为敏感。若被抑制剂污染，可过柱纯化，层析，透析或增加反应体积降低抑制剂浓度。
8. 识别位点不存在，需验证DNA序列是否正确。
9. 酶切位点被甲基化封闭，某些位点会被甲基化阻断，如果位点被阻断，应使用dam+/dam-菌株转化。另外真核基因组DNA可能被CpG甲基化阻断，可将其克隆到细菌宿主以消除影响。
10. DNA可能形成超螺旋，限制性内切酶消化超螺旋DNA效率是不一样的，需加大酶量。
11. 识别位点过于接近DNA末端，一般在识别为点两端各加上6个保护碱基，确保切割效率。
12. 位点优势效应，需要两个识别位点确保以达到有效切割。
Q: NEB限制性内切酶进行DNA酶切时，若出现非预期带型该如何解决？
A: 1. 首先要确定正确的带型，通常将对照底物DNA与酶切产物凝胶电泳，部分消化会有相应未消化底物条带，星号活性会产生非预期条带。
2. DNA样品污染，应重新制备DNA样品。
3. DNA含有其他识别位点，验证DNA序列。
Q: NEB限制性内切酶进行DNA酶切时，若DNA电泳呈现弥散状该如何解决？
A: 1. 酶与DNA结合紧密未完全解离，在凝胶上样缓冲液或反应终止液中加入SDS至终浓度为0.1-0.5%以帮助解离。
2.核酸酶污染，操作时应注意避免交叉污染。
3.琼脂糖电泳条件不当，应使用新鲜缓冲液及合适电压，避免过热。
Q: 什么是同裂酶？
A: 识别序列相同的限制性内切酶即为同裂酶。第一个被发现的内切酶称之为原酶，后来发现的识别序列相同的内切酶称之为同裂酶。
Q: NEB采用蓝冰运输的好处有哪些？
A: 1. 实验证明，使用蓝冰方法运输，既使到货时蓝冰已经溶化，泡沫塑料盒中的温度仍然能保持在4℃或4℃以下超过24小时。虽然NEB公司建议酶类产品贮存于-20°C，但在运输过程中，温度暂时维持在4°C至10°C之间不会对酶活性产生不良影响。事实上，在纯化这些产品的过程中，为了去除蛋白酶和其他可能影响酶稳定性的污染源时，所使用的温度就是4°C，并且纯化过程通常需要持续3周之久。此外，每种酶都贮存于NEB特定的贮存液中，该贮存液经过优化，对保持酶活的稳定性也会起到重要作用。
2.NEB产品贮存液中含有50％甘油，可以使酶在-35°C下保持液态。但是如果使用干冰运输，酶将被冷冻，如此反复冻
