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Luna® 通用探针一步法 RT-qPCR 试剂盒
Luna® Universal Probe One-Step RT-qPCR Kit
NEB Luna 通用探针一步法 RT-qPCR 试剂盒经过优化，适用于水解探针法的目标 RNA 序列实时定量。一步法 RT-qPCR 为 RNA 检测和定量提供了一种便捷、强大的方法。在同一管中，RNA 首先由反转录酶转化为 cDNA，然后使用 DNA 依赖型 DNA 聚合酶扩增 cDNA，从而可以进行 qPCR 定量。探针法 qPCR/RT-qPCR 原理是利用聚合酶的 5´→3´ 核酸外切酶活性，将淬灭的目标特异性探针切断发出荧光，并实时监测荧光值的增加，以测量每个循环中的 DNA 扩增。在荧光信号显著超过背景荧光的位置，可以确定循环数或 Cq 值。Cq 值可用于评估两个或多个样品的靶基因相对丰度，通过已知稀释浓度样品的标准曲线，可对靶基因进行绝对定量。
在 Luna 通用一步法探针 RT-qPCR 试剂盒中，联合使用热启动 Taq DNA 聚合酶与新型 WarmStart 反转录酶，通过适配体可逆抑制来双重控制酶活性。这种温控活化机制可避免热循环前的非特异扩增，从而让室温建立体系更安全。经改造的 Luna WarmStart 反转录酶的热稳定性比许多反转录酶更高，其最佳反应温度为 55℃。对于困难靶标/模板，最多可将反转录步骤的温度升至 60℃，不会影响 Luna 性能。
图 1：NEB 的 Luna 通用探针一步法 RT-qPCR 试剂盒具有更高的灵敏度、更出众的可重复性以及更优异的 RT-qPCR 表现 使用 Luna 通用探针一步法 RT-qPCR 试剂盒，执行了人 GAPDH 基因的 RT-qPCR 靶标检测，起始量模板为 8 个 10 倍梯度稀释的 Jurkat 总 RNA（1 μg – 0.1 pg），每个浓度的样品做 8 个重复。实验按照试剂盒建议的操作流程进行，反应中包含一个 55℃ 温育 10 分钟的反转录步骤，以便于具有热稳定性的 Luna WarmStart 反转录酶发挥作用。
图 2：NEB 的 Luna 通用探针一步法 RT-qPCR 试剂盒在多重检测中展现强大功效 使用 Luna 通用探针一步法 RT-qPCR 试剂盒，执行了人 GAPDH 基因、核糖体蛋白 L32g 和 PI3 激酶相关的激酶 SMG1 基因的多重 RT-qPCR 靶标检测。起始量模板浓度为 7 个 10 倍稀释的 Jurkat 总 RNA（1 μg – 1 pg），每个浓度的样品做 4 个重复。扩增图表如上所示，左边是叠加的结果，右边是每个基因单独的检测结果。若要解释拷贝数的差异，低拷贝的模板（SMG1）使用的引物浓度为 0.4 µM，高拷贝的模板（L32g 和 GAPDH）使用的引物浓度为 0.2 µM。Luna 产品在多重 RT-qPCR 检测中展现出卓越的效率、可重复性、灵敏度和性能。
图 3：通过与市售的探针法 RT-qPCR 试剂相比，Luna 产品展现出更好的稳定性和特异性 使用市售的 RT-qPCR 试剂对 7 个不同丰度、长度和 GC 含量的 RT-qPCR 靶标进行测试。测试均根据产品说明书进行，数据来源于两位实验人员。从以下方面评估了反应结果：扩增效率、低起始量检测能力及无模板扩增值（ΔCq = 无模板对照的平均 Cq – 最低起始量的平均 Cq）。此外，还评估了扩增结果的一致性、可重复性和总体曲线质量（质量分数）。柱状图展示了达到可接受的性能标准的目标百分比（由点图上的绿色框表示，质量分数 > 3）。NEB 和其它供应商的结果如下所示：Quanta，qScript™ XLT 1-Step RT-qPCR ToughMix®；ABI，TaqMan® RNA-to-Ct 1-Step Kit；QIAGEN，QuantiFast® Probe RT-PCR Kit；Bio-Rad，iTaq™ Universal Probes One-Step Kit；Promega®，GoTaq® Probe 1-Step RT-qPCR System。NEB 的 Luna 通用探针一步法 RT-qPCR 试剂盒性能优于其它测试试剂。
1、Luna 通用探针一步法反应混合液浓度为 2X，包含热启动 Taq DNA 聚合酶、dNTP 和所有必需的缓冲液成分。该预混液包含独特的惰性参比染料，可与多种 qPCR 仪器兼容，包括需要高 ROX 或低 ROX 参比信号的仪器。独具特色的是：预混液还包含可防止交叉污染的 dUTP，以及有助于观察反应体系建立的非荧光可见示踪染料。该示踪染料与 qPCR 常用荧光团的光谱没有重叠，因此不会干扰实时检测。
2、贮存条件：
建议贮存于 -20℃。
3、注意：
为确保 Luna WarmStart 反转录酶完全激活，建议温育温度不低于 50℃。
| 货号 | 产品名称 | 单位 | 购买 |
|---|---|---|---|
| 267-PLT-C-96 | 0.2 ml 96孔无裙边 PCR板 | 10 板/包，5 包/箱 | 商城订购 |
| BY-R0100 | 西班牙琼脂糖 | 商城订购 | |
| 244-PCR-C-0.2-BAG | 0.2ml PCR管 | 1000 个/包 | 商城订购 |
| 4381 | 0.1-2ul单道移液器 | 1 unit | 商城订购 |
| 4382 | 0.5-10ul单道移液器 | 1 unit | 商城订购 |
| 221-R-C-10S | 0.5-10ul 盒装灭菌吸头 | 96支/盒，10盒/组，5组/箱 | 商城订购 |
| 243-MCT-C-2.0 | 2.0ml微量离心管 | 500 个/盒，10 盒/箱 | 商城订购 |
| 货号 | 名称 | 单位 | 购买 |
|---|---|---|---|
| E3006S | Luna® 通用探针一步法 RT-qPCR 试剂盒 | 200 rxns | 商城订购 |
| E3006L | Luna® 通用探针一步法 RT-qPCR 试剂盒 | 500 rxns | 商城订购 |
| E3006X | Luna® 通用探针一步法 RT-qPCR 试剂盒 | 1000 rxns | 商城订购 |
| E3006E | Luna® 通用探针一步法 RT-qPCR 试剂盒 | 2500 rxns | 商城订购 |
| M3006B | Luna® 通用探针一步法 RT-qPCR 试剂盒 | 商城订购 |
