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Q5定点突变试剂盒（不含感受态细胞）;10rxns
Q5® Site-Directed Mutagenesis Kit (Without Competent Cells)
Q5 定点突变试剂盒（不含感受态细胞）可以在 2 小时内快速对双链质粒 DNA 进行定点突变（图 1）。该试剂盒使用稳定的 Q5 热启动超保真 DNA 聚合酶，结合客户自行设计的引物，在各种质粒中引入插入、缺失和替换突变。PCR 后将扩增材料直接添加到独特的激酶-连接酶-DpnI（KLD）酶混合液中，进行快速室温环化和模板去除（5 分钟）（图 2）。 将质粒转化到高效级 E. coli 感受态细胞（不随试剂盒提供），以确保转化长度至少为 20 kb 的质粒能获得稳定的结果。也提供含感受态细胞的试剂盒（NEB #E0554）
图 1：2 小时内完成定点突变。 使用预混液、独特的多酶 KLD 酶混合液和快速聚合酶可确保大多数质粒的突变反应在两小时内完成。
图 2：Q5 定点突变概览。 此试剂盒经优化设计，可快速有效地将插入、缺失和替换引入双链质粒 DNA。第一步是使用常规引物和 Q5 热启动超保真 DNA 聚合酶的预混液进行指数扩增。第二步是使用含有激酶、连接酶和 DpnI 的独特酶混合液一起温育。在这些酶的共同作用下，可实现 PCR 产物快速环化，并去除模板 DNA。最后一步是转化到高效级化学感受态细胞（不随试剂盒提供）。
图 3：Q5 定点突变试剂盒引物设计。 使用专门设计的正向（黑色）和反向（红色）引物，将替换、缺失和插入引入质粒 DNA。与依赖线性扩增的试剂盒不同，为 Q5 定点突变试剂盒设计的引物不会重叠，从而可以确保实现指数扩增的优势。A）通过在正向引物的中间引入所需更换的核苷酸（* 表示）来产生替换，在突变的 3´ 侧应包含至少 10 个互补核苷酸序列。设计的反向引物应让两条引物的 5´ 末端背靠背退火。B）通过对删除区域两侧设计标准的、非突变正向和反向引物，来进行缺失改造。C）将少于或等于 6 个核苷酸的插入引入正向引物的 5´ 末端，同时反向引物与正向引物的互补区域的 5´ 末端背靠背退火。D）可以通过将所需插入序列的一半引入两条引物的 5´ 末端以实现更大片段的插入。插入片段的大小上限很大程度上取决于寡核苷酸合成的限制。
图 4：NEB Q5 SDM 试剂盒比 Agilent QuikChange® SDM 试剂盒的转化效率更高。 图中显示了使用背靠背对照 SDM 引物混合液和对照 SDM 质粒（6.7 kb）进行的替换反应（4 nt）的结果，以及 12 nt 缺失实验（5.8 kb 质粒）和 18 nt 插入实验（7.0 kb 质粒）的结果。在这三种实验中，得到菌落的预期突变效率在 90% 以上。如果细胞在涂板前未稀释，则将结果标准化为转化子总数。为了进行比较，使用 QuikChange Lightning 定点突变试剂盒（Agilent）按照 Agilent 操作流程进行相同的替换反应（4 nt），并使用 Agilent 引物设计工具设计重叠引物。 *请注意，QuikChange 试剂盒不适用于这种大小的缺失和插入，因此无法对这些实验进行比较。
贮存说明：
Q5 定点突变试剂盒（不含感受态细胞）于 –20℃ 可稳定贮存两年。突变试剂和对照反应不含感受态细胞，任何适用于克隆的 E. coli 化学感受态细胞都可以使用，极大的增加了灵活性。
| 货号 | 产品名称 | 单位 | 购买 |
|---|---|---|---|
| 267-PLT-C-96 | 0.2 ml 96孔无裙边 PCR板 | 10 板/包，5 包/箱 | 商城订购 |
| 244-PCR-C-0.2-BAG | 0.2ml PCR管 | 1000 个/包 | 商城订购 |
| SI-0246 | Vortex-Genie2 多功能漩涡振荡器 | 1 set | 商城订购 |
| 244-PCR-C-0.2-BAG | 0.2ml PCR管 | 1000 个/包 | 商城订购 |
| 4381 | 0.1-2ul单道移液器 | 1 unit | 商城订购 |
| 4382 | 0.5-10ul单道移液器 | 1 unit | 商城订购 |
| 221-R-C-10S | 0.5-10ul 盒装灭菌吸头 | 96支/盒，10盒/组，5组/箱 | 商城订购 |
