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NEBuilder® 高保真 DNA 组装预混液
NEBuilder® HiFi DNA Assembly Master Mix
NEBuilder 高保真 DNA 组装试剂盒提供多种剂型：含 NEB 5-alpha 化学感受态细胞（克隆试剂盒，NEB #E5520），含 NEB 10-beta 化学感受态细胞（大片段组装试剂盒，NEB #E2623）；以及不含感受态细胞（预混液，NEB #E2621）。NEB 5-alpha 化学感受态细胞适用于小于等于 15 kb 片段的常规组装。 对于大于 15 kb 组装片段的转化，NEB 建议使用 NEB 10-beta E. coli 感受态细胞（高效级，NEB #C3019）或 NEB 10-beta E. coli 电转感受态细胞（NEB #C3020）。如果组装基因包含重复序列，应使用 NEB Stable E. coli 感受态细胞（NEB #C3040）。
NEBuilder 的应用：
1、定点突变
2、sgRNA-Cas9 表达载体构建
3、线性酵母表达框组装
产品优势：
1、组装后保真度高、正确率高，无需反复筛选、测序。
2、更高效地连接 DNA 片段，轻松应对更大片段或较低 DNA 起始量的组装
3、由于可去除 5´ 和 3´ 末端的不匹配序列，NEBuilder 高保真产品可进行连续组装。（省去耗时的 PCR 扩增步骤，节省时间）
4、使用合成的单链 DNA 寡核苷酸桥式连接两个双链 DNA 片段（如接头插入或 gRNA 建库），构建简单又快速
适用于较低的 DNA 起始量要求
5、NEBuilder 高保真产品可兼容使用 Gibson 组装® 预混液和 In-Fusion 组装预混液设计的片段，因此可轻松地从其它体系转用 NEBuilder 高保真产品
6、使用 NEBuilder 产品，无需缴纳授权费
图 1：不同于一般的 DNA 组装试剂
图 2：NEBuilder 高保真 DNA 组装方法概述
图 3：NEBuilder 高保真 DNA 组装提高了 4 个片段组装反应的效率
使用 NEBuilder 高保真 DNA 组装预混液（NEB #E2621）、GeneArt® Gibson 组装®混合液（Thermo Fisher #A46627）和 In-Fusion® Snap 组装预混液（Takara Bio USA #638947），组装具有 20 bp 重叠的四个片段（约 20 fmol），构建 pUC19 载体。在 50℃ 下进行组装反应，反应时间为 60 分钟或 15 分钟。将 2 μl 的每种组装后的混合物转化到 NEB 5-alpha E.coli 感受态细胞（NEB #C2987）中，并涂布到含 IPTG 和 X-Gal 的 LB/Amp 平板上。统计代表正确组装的蓝色菌落数（> 总菌落的 95%）。NEBuilder 高保真 DNA 组装预混液得到的菌落数多于两种竞品。
注意事项
为确保成功组装以及后续成功转化组装的 DNA，NEB 建议遵循以下做法：
1、DNA：如果所有 PCR 产物的总体积不超过组装反应体积的 20%，无需进行 PCR 产物纯化。PCR 产物体积过多会引入更多 PCR 产物中存在的 PCR 反应缓冲液和未使用的引物，从而降低高保真 DNA 组装和转化的效率。PCR 产物柱纯化可能会使高保真 DNA 组装和转化的效率增加 2–10 倍，在组装三个或更多 PCR 片段时，或组装长度超过 5 kb 的片段时，强烈建议进行 PCR 产物柱纯化。用于组装的纯化 DNA 可溶于 ddH2O（推荐使用 Milli-Q® 水或同等纯度的水）、TE 或其它稀释缓冲液。
2、插入片段：直接将片段组装到克隆载体中时，组装片段的浓度应比载体浓度高至少 2 倍。要将 4 个或更多片段组装到载体中，建议使用等摩尔比例的片段。
3、转化：NEBuilder 高保真 DNA 组装克隆试剂盒随附 NEB 5-alpha E. coli 感受态细胞（高效级，NEB #C2987），适用于小于等于 15 kb 组装产物的转化。也可使用除 BL21、BL21(DE3)、Lemo21(DE3)、Nico(DE3) 和 SHuffle®外的其它 NEB E. coli 感受态细胞。使用 NEB 以外的供应商的 E. coli 感受态细胞时，高保真 DNA 组装产物转化的稳定性会降低。
4、电转化：电转化可以将转化效率提高几个数量级。使用 NEBuilder 高保真 DNA 组装预混液时，取 1 μl 组装产物用于电转化，并将多种稀释度的菌液涂布到平板上。（如果需要使用电转感受态细胞，请遵守“电转感受态细胞转化操作流程”）
5、生物学特性：一些 DNA 结构，包括反向重复序列和串联重复序列，会被大肠杆菌选择性丢失。大肠杆菌无法耐受某些重组蛋白，因此可能会导致转化效率较低或菌落较小。
| 货号 | 产品名称 | 单位 | 购买 |
|---|---|---|---|
| 243-MCT-C-2.0 | 2.0ml微量离心管 | 500 个/盒，10 盒/箱 | 商城订购 |
| 244-PCR-C-0.2-BAG | 0.2ml PCR管 | 1000 个/包 | 商城订购 |
| SI-0246 | Vortex-Genie2 多功能漩涡振荡器 | 1 set | 商城订购 |
| 244-PCR-C-0.2-BAG | 0.2ml PCR管 | 1000 个/包 | 商城订购 |
| 221-R-C-10S | 0.5-10ul 盒装灭菌吸头 | 96支/盒，10盒/组，5组/箱 | 商城订购 |
| 货号 | 名称 | 单位 | 购买 |
|---|---|---|---|
| E2621L | NEBuilder® 高保真 DNA 组装预混液 | 50 rxns | 商城订购 |
| E2621S | NEBuilder® 高保真 DNA 组装预混液 | 10 rxns | 商城订购 |
| E2621X | NEBuilder® 高保真 DNA 组装预混液 | 250 rxns | 商城订购 |
