01

在 FFPE 组织蛋白质组学质谱分析中，彻底脱蜡是样本制备成败的关键。行业通用的二甲苯脱蜡方案，不仅存在安全毒性隐患，还难以保障实验重复性，同时制约样本处理通量。

我们推出APAC 蛋白富集捕获技术，以自适应聚焦超声（AFA）为核心，打造全新无毒脱蜡制备方案。该技术彻底摆脱对二甲苯的依赖，在提升蛋白解交联效率、保证蛋白组分析深度与丰度动态范围的同时，实现实验结果高度可重复。方法支持按需定制运行程序，兼容 Covaris 96 孔板，完美适配临床肿瘤队列的大批量样本研究，是 FFPE 组织质谱蛋白质组学领域安全、高效、可规模化应用的优选方案。

02

福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）是临床病理领域应用最广泛的样本制备方式。经福尔马林交联固定、石蜡包埋后的组织，不仅切片操作精准便捷，样本也能在室温下长期稳定存放，是临床样本资源的重要载体。

在 FFPE 样本的质谱蛋白质组学研究中，脱蜡是核心环节。传统工艺普遍采用二甲苯脱蜡，该试剂毒性高，对操作环境和人员防护要求严苛；同时繁复的操作步骤，既影响实验结果的稳定性，也会造成样本浪费。

针对以上痛点，我们创新整合 AFA 聚焦超声与改良蛋白富集捕获（PAC）技术，打造了无二甲苯FFPE 样本前处理方案。该技术可直接实现石蜡乳化分离与蛋白纯化，且灵活适配单管、八联管、96 孔板等多种规格，轻松实现规模化、高通量的质谱蛋白质组学分析。

使用设备：Covaris

LE220-plus Covaris Focusedultrasonicator (PN 500569)

03

本研究将人类腺瘤FFPE组织的蜡卷样本置于96孔板中开展前处理（图1A）。通过95℃加热联合AFA聚焦超声处理，同步完成组织蛋白解交联与石蜡乳化，体系最终形成乳白色均一溶液，证实石蜡已从组织中充分乳化并有效分离（图1A、B）。为实现体系中蛋白质的高效纯化，本研究在已报道的磁珠富集变性蛋白的PAC技术基础上进行方法优化（图1A、C）。蛋白与磁珠充分结合后，采用异丙醇洗涤体系去除残留石蜡，并辅以50℃恒温孵育强化洗涤效果。随着洗涤过程推进，浑浊的乳状上清液逐渐澄清，实现石蜡杂质的彻底去除（图1A、D）。最后，对吸附于磁珠上的蛋白质进行原位胰酶酶解，获得纯净肽段溶液；在LC-MS质谱检测前，采用SDB-RPS Stage Tips对肽段样品完成脱盐处理，获得可直接上机的待测样本（图1A、E）。

图1.96孔板中FFPE组织高效蛋白质组学样品APAC制备工作流程（无需二甲苯）。

A：综合热处理、AFA超声、优化的PAC实验方案样品制备工作流程概述。

B：加热和超声处理的结合可以快速高效地从FFPE组织中去除石蜡。显示了第一个超声循环后的样品裂解液。

C：Covaris 96孔板中，磁珠上沉淀蛋白质。

D：异丙醇从第一（左）到第五（右）洗涤步骤，快速平行地去除三个样品中的石蜡。

E：最后一步胰蛋白酶消化后无石蜡残留的澄清溶液。

为验证本研究建立的无二甲苯前处理流程与传统二甲苯脱蜡方案的性能等效性，本研究选取同一组织块来源的FFPE样本，分别采用两种脱蜡体系开展平行对比实验。结果显示，无二甲苯APAC流程与传统二甲苯方法获得的多肽及蛋白鉴定数量高度一致（图2A、B），且蛋白质丰度分布范围基本重合（图2C）。本研究平均每轮可定量约3900种蛋白质与20842条多肽，蛋白定量丰度可跨越5个数量级。同时，腺瘤经典标志物（EGFR、CTNNB1、CDH1）在两种处理方案中呈现出一致的蛋白表达水平（图2C）。

为进一步评估两种方法在福尔马林解交联效率上的潜在差异，本研究以赖氨酸甲基化作为评价指标开展分析。赖氨酸甲基化除生理性修饰外，也是福尔马林固定引发的交联副修饰，可直观反映样本解交联效果。对比结果显示，两种处理方式的赖氨酸甲基化修饰水平无显著差异（图2B），提示二者的蛋白解交联效率相当。两种方法中赖氨酸修饰肽段的甲基化比例均维持在约10%，与既往FFPE蛋白质组学研究报道结果一致，进一步证实APAC方法可实现与传统二甲苯体系等效的样本处理质量。

图2. 不含二甲苯的 APAC 法与基于二甲苯的经典方法之间的比较 

A：无二甲苯的APAC（红色）或基于二甲苯（蓝色）的方法从FFPE 组织中识别出的蛋白数量 

B： 存在赖氨酸甲基化修饰多肽数量及在总多肽数中的占比。

C： 方法之间的动态范围比较。 平均蛋白质丰度高于已鉴定蛋白质的总数。

为探究切片厚度对组织裂解效率与石蜡去除效果的影响，本研究分别采用3 μm与10 μm厚度的腺瘤FFPE切片开展对比测试。结果表明，两种厚度切片均可为质谱检测提供充足的样本量；相较于3 μm切片，10 μm切片可获得更高的多肽产出率（图3A）。但切片厚度并未对蛋白鉴定总量产生显著影响，两种厚度样本的蛋白质鉴定数量无明显差异（图3B）。

图3．APAC方法分别处理不同厚度的切片

A．10和3μmFFPE切片在多重纯化后的多肽产量（以μg为单位）

B，两种切片蛋白质数量比较（n=8)。

为进一步验证APAC工作流程的实验可重复性，本研究基于结直肠腺瘤FFPE组织开展重复性验证实验。实验从同一结直肠腺瘤样本的三张连续FFPE切片中各选取多组区域，共计设置7份待测样本。结果显示，除切片1的第4号样本外，其余所有样本均可定量鉴定出3500种以上蛋白质（图4A）。三张切片不同取样区域的蛋白定量生物学变异系数分别为32.6%、19.8%与24.5%（图4B）。在总计鉴定获得的4681种蛋白质中，有4353种蛋白质可在三张切片中共同定量检出，共有蛋白占比高达93%（图4C）。各组蛋白质组定量结果的皮尔森相关系数中位数可达0.96，充分证实APAC方法具备优异的技术重复性与稳定性（图4D）。

图4．我们的方法在临床样本中获得了很高的重现性；

A：FFPE腺瘤组织的三个连续切片7个样本定量蛋白质数量

B：每个切片工作流程产生的的变异系数

C：比较不同部位的蛋白质鉴定情况

D：Pearson 相关矩阵，包括工作流程和生物学重复。所有分析样品的中位数相关系数证明了整个矩阵的重复性。