基因组学的终极目标，是同时看清序列、结构、单倍型分型、三维空间构象与功能表型的完整关联。然而长期以来，短读长测序与传统 Hi-C 技术存在难以逾越的瓶颈，复杂区域、重复序列、低起始量样本如同 “黑洞”，让高质量基因组组装与精准三维互作分析举步维艰。

PacBio HiFi高精准长读长测序技术，兼具长度（10–25 kb）与精度（Q30 以上）；直接跨越复杂重复区域，实现端粒到端粒（T2T）无缺口组装，彻底解锁基因组暗区；无GC偏好，保留最真实的基因组覆盖；支持单倍型分型，轻松区分同源染色体的等位差异。可以说HiFi 解决了 “序列组装” 的难题，但三维构象仍依赖 Hi-C；而 CiFi技术的问世，为我们改写了三维基因组学与基因组组装规则。

加州大学戴维斯分校Megan Dennis团队联合PacBio开发出一种全新的染色质构象捕获技术——CiFi（Chromatin Interaction HiFi），该技术将传统3C与HiFi高精准长读长测序技术相结合，能够分析重复序列区域的基因组相互作用。该研究成果2025 年12月发表于《Nature Communications》杂志。

CiFi 的核心是融合传统3C与HiFi 测序，具体流程为：首先利用甲醛交联固定细胞核内真实的染色质空间互作，再通过限制性内切酶切割染色质并保留片段间的邻近关系，随后进行原位邻近连接，将原本空间上相互作用的片段连接为一条完整的串联长链；在此基础上通过高保真全基因组扩增高效富集未交联的 DNA 分子，最终进行 HiFi 长读长测序，使单条测序读长即可直接读取多段互作序列，一次性同步获取序列信息、基因组位置、三维互作关系与单倍型分型四层关键信息。

• 显著提升重复区域片段比对率

与Illumina Hi-C 相比，CiFi 在非唯一基因组区域的代表性与覆盖度更优，包括：短散在核元件（SINE）：Alu、Mir；长散在核元件（LINE）：L1、L2；片段重复（SD）：90% 一致性（SD）与 98% 一致性（SD98）；着丝粒及着丝粒过渡区域。其中SD与着丝粒区域的提升最显著：Illumina Hi-C 仅 33–37% 的读长满足 MAPQ≥1，而 HindIII CiFi 可达 83–89%。

图1.短读长和长读长 3C 方法的片段映射显示，CiFi在重复区域（如 SINEs、LINEs、片段重复和着丝粒区域）表现更优

CiFi 长读长对单倍型分型同样具有显著提升效果，对 CiFi 读长内 30 Mbp 范围内、分型一致片段的同源片段推定分型，最终可保守地为80.3% 的 CiFi 片段分配单倍型，而 Hi-C 仅为 10.9%。

• 提供丰富的染色质互作解析

利用染色质互作可将基因组划分为拓扑关联结构域（TAD），即内部互作频率显著高于相邻区域的基因组区段。对 TAD 分析中的缺口区域统计显示：CiFi 技术在人类常染色体上的缺口占比约为 2%，而传统 Hi-C 技术约为 5%；二者在重复区域的差异更显著，SD区域 CiFi 的缺口为 8.6%、Hi-C 为 18%，着丝粒区域 CiFi 的缺口为 15%、Hi-C 为 34%。同时，CiFi 检测到热点区域侧翼SDs无交叉；而 HiC 存在 8% 的缺口。此外，CiFi显示出更多的远距离染色体内相互作用。

图2.CiFi提供更丰富的染色质互作解析（左：TAD分析中CiFi在重复区域表现更优；右：CiFi 能捕获更多长距离染色质互作）

• 低起始量及小型样本适配

为检测低起始量适配性，研究人员将 GM12878 DpnII CiFi 样本稀释 100 倍以上：从 1000 万个细胞（~60 μg DNA）降至 6.2 万个细胞（~370 ng），所有起始量的测序指标与互作矩阵均保持稳定。

该技术还成功应用于单只冈比亚按蚊与地中海实蝇，验证了其在小型生物样本中的优异性能。在单只按蚊中，研究人员获得 2.37M HiFi reads和 21.1M长度中位数为 509bp 的片段，完整解析了全基因组染色质互作；在单只地中海实蝇中，结合 HiFi 全基因组测序与 CiFi 技术，完成了约 600 Mbp 基因组的染色体水平二倍体分型组装，清晰解析了 Y 染色体易位等复杂结构。

图3.利用HiFi和CiFi测序对单个地中海实蝇进行de novo二倍体组装。

2026 年，同一团队将 CiFi 全面升级，以单文库 HiFi-CiFi 联合测序策略为核心，完成了草原田鼠与草甸田鼠的染色体水平高质量二倍体基因组组装，并首次完整解析出与配对结合行为直接相关的 Avpr1a（加压素 1a 受体） 物种特异性重复，为社会行为的遗传机制研究提供了关键资源与技术范式。

传统大型哺乳动物基因组组装，需整合长读长测序、短读长 Hi-C 等多平台数据，不仅流程繁琐、成本高昂，还难以保证数据来自同一个体，更易在重复区域产生缺口与错误。本研究突破性地将 HiFi 测序与CiFi 染色质构象捕获技术深度融合，构建单一 SMRTbell 文库，仅用单个个体的肝脏组织，一次 Revio 测序就同时获得两类核心数据：用于基因组从头组装的高精度长读长数据，以及用于染色体挂载、单倍型分型的三维染色质互作信息，彻底告别多文库、多平台的繁琐流程。

研究分别从雄性草原田鼠与雄性草甸田鼠的肝脏组织中分离gDNA并固定染色质。HiFi 基因组 DNA 片段化至目标平均长度 16 kbp；CiFi DNA 采用 HindIII 限制性内切酶按标准流程制备，平均片段长度～8 kbp。两种产物按90:10 摩尔比（HiFi:CiFi）混合，构建为单一文库。每个物种在 Revio 平台上各用一个 SMRT Cell 测序，分别产出 102.7 Gbp（草原田鼠）与 98.2 Gbp（草甸田鼠）数据，中位读长质量 QV38。团队最终利用该联合测序方案完成了分型二倍体基因组的支架构建，获得了单倍型解析、染色体水平的 2.3 Gbp 基因组，质量值 QV 约 62，BUSCO 完整性 99.3%。草原田鼠二倍体组装显示contig N50 从旧版短读长参考基因组的 29.2 kb 提升至 39.2 Mb，缺口比例从 8.0% 降至 0.07%，实现了组装质量的跨越式升级，且 CiFi 的挂载效果全面优于传统 Hi-C。

表1.草原田鼠和草甸田鼠基因组组装质量及与旧版参考基因组对比

草原田鼠是哺乳动物中极少数表现出社会单配制、形成稳定配对结合的物种，而近缘的草甸田鼠无此行为，二者分化不足 400 万年，是解析社会行为遗传基础的理想模型。凭借 CiFi 技术带来的无缺口高质量组装，团队首次完整解析出草原田鼠特有的 Avpr1a 118 kb 片段重复——这一关键结构变异在旧版短读长参考基因组中完全缺失，长期阻碍了相关研究。

图4.草原田鼠与草甸田鼠的跨物种比较

该重复包含两个 Avpr1a 旁系同源基因，位于草原田鼠 26 号染色体，中间被物种特异性的着丝粒卫星序列分隔；其中 Avpr1a2 存在移码突变，编码截短型蛋白，但仍在大脑内侧视前区等关键区域稳定表达，直接与配对结合行为相关。拷贝数分析证实，该重复为草原田鼠独有，其他田鼠物种均未检出，为社会行为的物种分化提供了核心遗传靶点。此外，研究还系统解析了两种田鼠的染色体结构重排、性染色体演化、重复序列扩张等全基因组差异，证实调控区域分化而非编码序列改变，是二者行为分化的核心驱动因素。

这项研究不仅完成了两项田鼠的高质量参考基因组，更重要的是，验证了HiFi-CiFi 单文库策略在大型哺乳动物基因组组装中的可行性与优越性。与 “理想” 多平台方案相比，该方法成本降低至少三倍，同时实现了序列、结构、三维构象与单倍型的全面解析。CiFi 技术凭借低起始量、高重复区解析能力、多触点互作等优势，突破了传统 Hi-C 的技术瓶颈，为复杂基因组、行为遗传学、演化生物学研究提供了高效、低成本的全新方案。