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想要一张完美的免疫荧光图？这6个实验细节你必须知道
免疫荧光(Immunofluorescence, IF)将抗体识别和荧光成像技术结合起来，以直观观察固定细胞或组织样本中的靶蛋白和其它生物分子。这一过程可以揭示靶蛋白的定位、相对表达甚至激活状态。IF的强大之处在于能同时提供图像化、可量化的数据。
想获得一张高质量的荧光图，除按照我们推荐的IF操作步骤外（IF 操作步骤详解），这里给出几点关于IF染色的小建议。希望你get到~
优化细胞密度和改善细胞健康状态
细胞健康状态
细胞的状态会直接影响你的实验结果。若你因为愉快过周末而把细胞遗忘在培养箱的角落，或平日里照顾不周，细胞极可能会突变成多核细胞、形成应激颗粒、遭到支原体污染或出现死亡细胞碎片（如下图）。
细胞密度
要确保细胞密度对相应细胞类型和靶标而言是适宜的。有些蛋白会受密度影响产生重新定位，比如YAP。
细胞密度会对YAP蛋白的胞质与核定位产生影响。
使用YAP (D8H1X) XP® Rabbit mAb #14074（绿色），对低密度MCF 10A细胞（左图）和高密度MCF 10A细胞（右图）进行共聚焦IF分析。下排图像中的蓝色伪彩= DRAQ5® #4084（DNA荧光染料）。在低密度（增殖）细胞中观察到YAP蛋白的核定位信号增加、胞质定位信号降低。
有时候我们需要观察高密度培养的细胞信号，比如使用ZO-2（如ZO-2 Antibody #2847）观察紧密连接。然而，如果细胞密度过高，视野中无可界定的边缘，所拍摄的图片将不具说明意义。另一方面，如果细胞密度过低，你能选择拍摄的视野就会非常有限。
固定剂的选择
通过化学试剂处理样本，从而固定细胞结构和蛋白分布。免疫荧光的固定剂可以分为交联类固定剂和有机溶剂类固定剂。
交联类固定剂大多采用的是甲醛、多聚甲醛等醛类物质，这一类固定剂通过醛基与蛋白质发生交联反应，形成网络，保持蛋白质的位置和结构，是最常用的固定剂。
在少数情况下，可能会用到有机溶剂类固定剂，如甲醇、丙酮等。它们是通过引发脱水/变性蛋白质的方式对组织进行固定。靶蛋白变性可能会将通常隐藏的表位暴露出来，因此该方法对某些抗体而言存在一定优势。然而，脱水性固定剂不太适用于可溶性靶标和修饰特异性抗体，比如磷酸化抗体等。
具体使用何种样本固定剂，可查看特定的抗体说明书。
最佳固定剂可能因不同的抗体/靶标而变化。Keratin 8/18 (C51) Mouse mAb #4546与甲醇固定法配合使用最佳(上图)。使用#4546（绿色），对使用甲醛固定的HeLa细胞（上左图）或使用甲醇固定的HeLa细胞（上右图）进行共聚焦IF分析。红色=Propidium Iodide (PI)/RNase Staining Solution #4087。AIF (D39D2) XP® Rabbit mAb #5318与甲醛固定法配合使用最佳(下图)。使用#5318（绿色），对使用甲醛固定的HeLa细胞（下左图）或使用甲醇固定的HeLa细胞（下右图）进行共聚焦IF分析。红色=Propidium Iodide (PI)/RNase Staining Solution #4087。
通透剂的选择
通透，就是在细胞膜上打孔，使封闭液和抗体能够进入细胞。一般情况下，采用醛类固定剂固定的样本需通透细胞膜，而有机溶剂类固定剂本身就可以通透细胞膜，固定后的细胞不需要再增加通透步骤。通透一般采用表面活性剂Triton-XTM 100，少数情况下，采用甲醇作为通透剂会得到更好的染色效果，可增强某些靶标（尤其是与细胞器或细胞骨架相关的靶标）的信号强度。同固定一样，最佳通透化方法也根据所使用的抗体来调整确定。请参见产品说明书中的建议方法。
PDI (C81H6) Rabbit mAb #3501和ß-Actin (8H10D10) Mouse mAb #3700与甲醇通透化配合使用最佳：使用#3501（绿色）和#3700（红色），以0.3% TritonTM X-100（左图）或甲醇（右图）进行通透化处理，对NIH/3T3细胞进行共聚焦IF分析。蓝色伪彩= DRAQ5® #4084（DNA荧光染料）。
封闭剂的选择
封闭步骤可减少一抗和二抗与非靶标位点进行非特异性结合时所产生的本底信号。理想情况是，封闭剂将占据样本中的“黏性”位点，比如暴露的带电性或疏水性蛋白表面，同时不会干扰一抗/二抗识别靶表位，从而尽可能提高信噪比(S/N)。
此步骤中使用的最佳封闭剂根据所使用的抗体进行调整；请参见产品说明书中的建议。我们最常建议使用的是在PBS中加入5%正常山羊血清（或使用与二抗同物种来源的血清）+0.3% Triton® X-100。Cell Signaling Technology（CST）还提供另一种封闭剂Image-IT® FX Signal Enhancer #11932，这种封闭剂可减少荧光基团和已固定样本之间产生非特异的、基于电荷的相互作用。
一抗的选择
选择经严格验证的抗体至关重要 ！
一抗是IF实验的关键成分，其特异性和灵敏度是免疫荧光成功与否的关键。如果一抗灵敏度不高，信号会比较弱，如果特异性不强，染色就会哪哪儿都是。更有特异性差的抗体，明明应该识别核蛋白，却在胞质里玩的不亦乐乎，使整个荧光结果“面目全非”。
去哪里才能找到非常合适免疫荧光一抗呢？小编经过多年苦心钻研，吐血推荐CST！！！这里的抗体质量稳定，灵敏度高、特异性强，是免疫荧光成功的不二法门。
CST抗体针对IF实验的特异性、灵敏度等进了严格的内部验证。
某抗体在WB分析中显示清晰条带并不能充分保证其在IF分析中也具备相应良好表现和可靠性。使用α-Synuclein (D37A6) XP®Rabbit mAb #4179或另一家公司的α-Synuclein抗体，对小鼠和大鼠的脑提取物进行WB分析（左图）。使用#4179（上排）或另一家公司的抗体（下排），对[小鼠]中脑下部和海马体切片进行共聚焦IF分析（右图）。白色箭头表示另一家公司的抗体错误地将α-Synuclein标记在神经元胞体/细胞核。
一抗稀释
请务必按照建议的稀释比例使用抗体，以便获得较高的信噪比(S/N)。CST的科学家们通常会使用阳性和阴性细胞系进行滴定测试，以发现既能提供最佳信号又能最大程度降低本底染色的理想浓度，从而为您提供最佳建议。CST提供的经IF验证的每种抗体的建议稀释比例在各自的产品说明书中均有明示。
二抗的选择
在IF实验中，通常采用两种方式来检测目标蛋白：一是直接使用与荧光基团共价偶联的一抗（直接检测）；二是更多情况下分两步进行，即先使用未标记的一抗，再使用与荧光基团偶联的二抗（间接检测），进一步放大样本信号。
选择二抗时除了要与一抗匹配之外，还要考虑荧光基团的颜色、稳定性等因素对成像效果的影响。
1）荧光基团的颜色：
每一个荧光基团都有它特定的激发光谱和发射光谱，选择荧光基团的时候，既要考虑实验的需求，也要考虑显微镜的光源和滤光片配置。常见荧光基团的激发光和发射光如下表所示：
2）荧光基团的稳定性
荧光基团长时间暴露在光下（尤其是显微镜的汞灯、激光器等强光源下），容易发生淬灭。建议选用Alexa Fluor®️系列或DyLight™️系列的荧光基团标记的抗体。这类荧光基团具有更强的信号强度，更好的光稳定性，耐受更广泛的pH范围，可以很好地减少荧光淬灭。目前，CST用于免疫荧光的二抗，大都是Alexa Fluor®️系列基团标记的。
3）强烈建议的免疫荧光二抗
且CST 的免疫荧光二抗，与传统二抗的最大差异点是：CST的是F(ab')2片段抗体（比如这个Anti-rabbit IgG (H+L), F(ab')2 Fragment (Alexa Fluor® 488 Conjugate) #4412），减少了非特异，降低背景！CST的荧光二抗更亮，稳定性更好，这是很多客户一直选用CST荧光二抗的理由。
CST F(ab')2片段荧光二抗的优势：
1. F(ab')2片段抗体消除了抗体Fc部分与细胞（如巨噬细胞、树突细胞、中性粒细胞、NK细胞和B细胞）上的Fc受体之间的非特异性结合。
2. 由于体积较小，片段抗体可更有效地渗入组织。
3. F(ab')2片段由羊抗体制备而来，并已经人IgG和人血清吸附。交叉吸附能显著降低背景。
其它推荐的配套试剂
使用与一抗匹配的优化试剂和操作流程能够大大改善您的实验结果。CST提供丰富的试剂和试剂盒，全力协助您开展免疫荧光实验。CST也是使用这些试剂来验证一抗是否适用于免疫荧光实验。
IF实验应用试剂盒：
封闭剂
封片液
基因有限公司作为CST在中国区的长期合作伙伴，将持续为您提供优质的产品、专业的技术支持与完善的售后服务。如需了解更多产品详情，请扫码添加下方技术人员微信！
您在IF实验中遇到过哪些问题？欢迎在评论区留言交流！
