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从抗体到微珠：免疫（共）沉淀实验的选择攻略
免疫沉淀（Immunoprecipitation, IP），它利用抗原与抗体之间的特异性反应，从不均一的细胞或组织提取物中富集特定蛋白质。在免疫沉淀过程中，特异性识别目的蛋白（抗原）的抗体被用来捕获这种蛋白质，目的蛋白被捕获后，通过添加如Protein A或G微珠等亲和层析介质来沉淀抗原-抗体复合物，然后通过洗涤以去除未结合的物质，获得富集后的蛋白。最后，可以使用Western Blotting （WB）、质谱分析等方法来鉴定和分析所获得的目标蛋白质。
免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation, Co-IP）则通过富集天然状态下的蛋白质复合物来研究蛋白质-蛋白质相互作用。一种蛋白质（称为“诱饵”）是免疫沉淀的目标，复合物中的另一种蛋白质（称为“猎物”）被用于下游分析。免疫共沉淀实验是在非变性条件下进行的，以保持蛋白质复合物的完整性。
在IP或Co-IP实验中，有几个主要的关键点和试剂选择，包括靶标抗体、微珠、同型对照、裂解液、检测试剂等，我们该怎么选择呢？
裂解液的选择
Cell Lysis Buffer（10X）（#9803）和 RIPA Buffer（10X）（#9806）均可用于制备总的细胞裂解液进行WB实验。但是，对于天然蛋白状态下细胞样本IP/Co-IP实验，我们推荐使用Cell Lysis Buffer (10X) #9803，并在使用前添加1mM PMSF。因为RIPA缓冲液含有离子型脱氧胆酸钠，破坏核膜、防止蛋白质降解并且不干扰蛋白质的免疫反应性和生物学活性的同时，可以使激酶变性并阻止蛋白质-蛋白质相互作用。
TIPS：超声处理在提取核蛋白和膜蛋白时至关重要。超声可以充分破碎细胞核和DNA，使蛋白尽可能的释放出来，且不会破坏绝大部分的蛋白与蛋白相互作用。
为了获得最佳结果，我们建议使用新鲜制备的裂解物。如有需要，样品可以分装保存在-80°C，避免反复冻融。
对于IP/Co-IP实验，我们建议在裂解液中添加混合型蛋白酶抑制剂（Protease Inhibitor Cocktail (100X) #5871）和PMSF。如果检测的是磷酸化蛋白，需要额外添加混合型磷酸酶抑制剂（Phosphatase Inhibitor Cocktail (100X) #5870，或者直接添加Protease/Phosphatase Inhibitor Cocktail(100X) #5872，以避免靶标蛋白的降解和磷酸化信号的丢失。
抗体的选择
IP还是Co-IP？
请留意：有些品牌适用于IP实验的抗体是只能做IP，不能或不一定能做Co-IP。Cell Signaling Technology（CST）品牌能做IP的抗体，也是能做和质保Co-IP的。
IP抗体分类
按检测靶标分类：分为内源性靶标蛋白抗体（用于内源表达蛋白检测），翻译后修饰抗体（用于蛋白翻译后修饰检测，包括位点特异性PTM抗体，基序抗体，PTM特异性抗体），以及标签蛋白抗体（用于外源IP实验所使用的表位标签蛋白检测）。
CST翻译后修饰抗体概览
常见标签列表
按偶联类型分类：分为非偶联抗体（抗体同裂解物孵育后，需要额外添加并孵育微珠），和微珠偶联抗体（抗体与微珠（磁珠或琼脂糖珠）已经预先偶联，可以与裂解液通过一步法进行孵育。CST提供与微珠预先偶联的标签抗体，内源性靶标蛋白抗体以及同型对照）。
TIPS：经充分验证的抗体至关重要！
一抗是影响数据质量的关键试剂。低质量一抗可能产生模糊、难以解读或误导性结果。想要确信抗体对目的靶标具有特异性，则应验证抗体特异性。在预期分子量处看到条带，不能简单的说明抗体的特异性。CST®抗体经过了严格的验证流程，这种流程采用众多不同方法来确保抗体能准确检测出靶标。
同型对照的选择
同型对照是实验中必需的阴性对照。IP实验中使用的同型对照应与一抗的IgG亚型相匹配。兔子只有一个IgG亚类，因此选择同型对照相对简单。我们建议使用Normal Rabbit IgG #2729 搭配兔多克隆抗体进行实验，使用Rabbit (DA1E) mAb IgG XP® Isotype Control#3900 搭配兔单克隆抗体进行实验。
使用小鼠来源的一抗时，选择同型对照相对复杂，因为小鼠有四个IgG亚型：IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3。特定CST抗体的亚类可在产品网页的来源/同型部分找到。CST提供以下同型对照以匹配我们的小鼠来源的一抗：
• Mouse (G3A1) mAb IgG1 Isotype Control #5415
• Mouse (E5Y6Q) mAb IgG2a Isotype Control #61656
• Mouse (E7Q5L) mAb IgG2b Isotype Control #53484
• Mouse (E1D5H) mAb IgG3 Isotype Control #37988
TIPS：在同一IP实验中，需要按照等质量添加IP一抗以及对应的同型对照。同型对照体积 =（目标蛋白抗体体积*目标蛋白抗体浓度）/ 同型对照浓度。请注意，如同型对照添加体积太小，需要稀释后再添加。
微珠的选择
免疫沉淀实验中所使用的微珠通常为琼脂糖珠或者磁珠。琼脂糖珠用于通过离心将免疫复合物从样品中分离出来，而磁珠则使用专门的磁力架进行分离。
Protein A/G微珠
当使用非偶联抗体进行免疫沉淀时，通常选择与Protein A或Protein G结合的珠子进行IP或Co-IP。Protein A和Protein G在IP反应过程中直接结合抗体的Fc结构域，并促进后续的分离。
CST为IP实验提供以下Protein A/G微珠供选择：
选择建议
一般建议，对于未偶联的兔IgG抗体选择Protein A结合的珠子，或对于未偶联的小鼠IgG抗体选择Protein G结合的珠子。
有关Protein A和Protein G对各种抗体宿主物种和免疫球蛋白亚型的相对结合亲和力的更多详细信息，请参考下表。
-，无结合；＋，弱结合；++，中度结合；+++，强结合。
以上表格改编自David S. Hage所著的《亲和色谱手册》(ISBN 0824740572) 中 Terry M. Phillips撰写的第14章 “抗体和抗原纯化中的亲和层析技术”。
链霉亲和素微珠结合物
对于使用生物素化抗体的IP实验，可以使用链霉亲和素微珠（磁珠#5947，琼脂糖珠#3419）代替Protein A或Protein G微珠。当靶标蛋白接近25 kDa抗体轻链或50 kDa重链时，这种免疫沉淀方法可能更有利于规避下游蛋白质印迹分析时可能出现的抗体轻重链遮蔽的问题。
IP后WB二抗的选择
这涉及到IP/WB实验中，重轻链遮蔽问题：
当进行IP/WB实验时，用于IP的一抗的变性IgG轻链和重链在蛋白质印迹物上分别定位在约25和50 kDa处，并且往往可能掩盖分子量相似的靶标蛋白条带。来自同一宿主动物的抗体既用于IP又用于WB是导致此结果的原因。WB实验中所用的二抗不仅检出用于一抗孵育的天然IgG，还检出用于IP的抗体的变性重链与轻链。
重轻链遮蔽问题应对方法及二抗的选择
1. 使用来自不同物种的抗体用于IP和WB。例如，兔抗用于IP而鼠抗用于WB，或反之亦然。在这种情况下，WB二抗将不会识别来自其他物种的IP一抗的IgG。请注意，二抗需有物种特异性。我们的内部验证实验使用Anti-rabbit IgG, HRP-linked Antibody #7074 和Anti-mouse IgG, HRP-linked Antibody #7076 进行，这些抗体分别对兔和小鼠IgG高度特异。我们未在这些二抗中观察到物种交叉反应性。
2. 来自相同物种的生物素化一抗用于蛋白质印迹法。可以使用不会与变性IgG交叉反应的Streptavidin-HRP #3999 检测生物素化抗体。
3. 如果您的靶标不在25 kDa附近，则可以使用轻链特异性二抗进行检测。CST提供以下针对不同物种IgG的轻链特异性二抗。
4. 使用优先结合天然IgG的Protein A (HRP Conjugate) #12291 替换WB中的二抗。需要注意的是，#12291 可能依旧会与高浓度的变性IgG发生交叉反应。
5. 使用构象特异性二抗用于WB。CST提供优先结合天然构象下IgG的Mouse Anti-Rabbit IgG (Conformation Specific)(L27A9) mAb (HRP Conjugate) #5127。在使用#5127 作为二抗时，请使用新鲜的SDS+DTT缓冲液（不建议使用BME）并在95-100°C下加热2-5分钟。变性不足可能导致高背景，如150KD,50KD或25KD信号的检出。
小结
Cell Signaling Technology 提供对免疫沉淀 (IP) 严格验证过的抗体，包括对照、二抗、表位标记抗体和微珠偶联抗体。同时还提供针对 IP 实验进行过全面评估的试剂、缓冲液、微珠和其他配套产品。
同型对照抗体 | |
CST#3900 | Rabbit (DA1E) mAb IgG XP® Isotype Control |
CST#3423 | Rabbit (DA1E) mAb IgG XP® Isotype Control (Sepharose® Bead Conjugate) |
CST#8726 | Rabbit (DA1E) mAb IgG XP® Isotype Control (Magnetic Bead Conjugate) |
CST#4096 | Rabbit (DA1E) mAb IgG XP® Isotype Control (Biotinylated) |
CST#2729 | Normal Rabbit IgG |
CST#5415 | Mouse (G3A1) mAb IgG1 Isotype Control |
CST#5873 | Mouse IgG (Magnetic Bead Conjugate) |
CST#3420 | Mouse IgG (Sepharose® Bead Conjugate) |
CST#4097 | Mouse (MOPC-21) mAb IgG1 Isotype Control (Biotinylated) |
CST#61656 | Mouse (E5Y6Q) mAb IgG2a Isotype Control |
CST#37988 | Mouse (E1D5H) mAb IgG3 Isotype Control |
CST#53484 | Mouse (E7Q5L) mAb IgG2b Isotype Control |
二抗 | |
CST#3678 | Mouse Anti-rabbit IgG (Conformation Specific) (L27A9) mAb |
CST#5127 | Mouse Anti-rabbit IgG (Conformation Specific) (L27A9) mAb (HRP Conjugate) |
CST#45262 | Mouse Anti-rabbit IgG (Light-Chain Specific) (D4W3E) mAb |
CST#93702 | Mouse Anti-Rabbit IgG (Light-Chain Specific) (D4W3E) mAb (HRP Conjugate) |
CST#58802 | Rabbit Anti-Mouse IgG (Light Chain Specific) (D3V2A) mAb (HRP Conjugate) |
CST# 91196 | Goat Anti-Mouse IgG, Light-Chain Specific Antibody (HRP Conjugate) |
CST#98164 | Goat Anti-Rat IgG, Light-Chain Specific Antibody (HRP Conjugate) |
CST#14708 | Anti-rabbit IgG (H+L), Biotinylated Antibody |
CST#14709 | Anti-mouse IgG (H+L), Biotinylated Antibody |
CST#5946 | Anti-mouse IgG (H+L), F(ab')2 Fragment (Sepharose® Bead Conjugate) |
CST#6990 | Anti-rabbit IgG F(ab')2 Fragment (Sepharose Bead Conjugate) |
表位标签抗体，微珠和生物素偶联物 | |
CST#70569 | DYKDDDDK Tag (D6W5B) Rabbit mAb (Binds to same epitope as Sigma's Anti-FLAG®M2 Antibody) (Sepharose®Bead Conjugate) |
CST#2908 | DYKDDDDK Tag Antibody (Binds to same epitope as Sigma's Anti-FLAG® M2 Antibody) (Biotinylated) |
CST#2912 | GFP (D5.1) Rabbit mAb (Biotinylated) |
CST#11847 | GST-Tag (26H1) Mouse mAb (Magnetic Bead Conjugate) |
CST#5017 | HA-Tag (C29F4) Rabbit mAb (Biotinylated) |
CST#11846 | HA-Tag (C29F4) Rabbit mAb (Magnetic Bead Conjugate) |
CST#3956 | HA-Tag (C29F4) Rabbit mAb (Sepharose® Bead Conjugate) |
CST#8811 | His-Tag (27E8) Mouse mAb (Magnetic Bead Conjugate) |
CST#4079 | His-Tag (27E8) Mouse mAb (Sepharose® Bead Conjugate) |
CST#15070 | His-Tag (D3I1O) XP® Rabbit mAb (Biotinylated) |
CST#82437 | His-Tag (D3I1O) XP® Rabbit mAb (Sepharose® Bead Conjugate) |
CST#3946 | Myc-Tag (71D10) Rabbit mAb (Biotinylated) |
CST#5698 | Myc-Tag (9B11) Mouse mAb (Magnetic Bead Conjugate) |
CST#3400 | Myc-Tag (9B11) Mouse mAb (Sepharose® Bead Conjugate) |
其他微珠试剂 | |
CST#9863 | Protein A Agarose Beads |
CST#73778 | Protein A Magnetic Beads |
CST#37478 | Protein G Agarose Beads |
CST#70024 | Protein G Magnetic Beads |
CST#5947 | Streptavidin (Magnetic Bead Conjugate) |
CST#3419 | Streptavidin (Sepharose® Bead Conjugate) |
缓冲液、试剂与其他免疫沉淀实验用品 | |
CST#5872 | Protease/Phosphatase Inhibitor Cocktail (100X) |
CST#5870 | Phosphatase Inhibitor Cocktail (100X) |
CST#5871 | Protease Inhibitor Cocktail (100X) |
CST#9038 | Cell Fractionation Kit |
CST#9803 | Cell Lysis Buffer (10X) |
CST#9806 | RIPA Buffer (10X) |
CST#9808 | Phosphate Buffered Saline (PBS-20X) |
CST#9852 | Chaps Cell Extract Buffer (10X) |
CST#8553 | PMSF |
CST#7017 | 6-Tube Magnetic Separation Rack |
CST#14654 | 12-Tube Magnetic Separation Rack |
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