来自国内某医学检验公司等单位的作者于2024年3月在BMC Genomics发表的文章中，平行比较了在文库构建中分别使用基于超声的片段化和基于酶切片段化方法的肿瘤DNA样本，检测到一些意想不到的低变异等位基因。作者通过分析得出以下结论，发现基于酶法DNA片段化引入的artifact reads（主要是SNV单核苷酸位点变异和Indels插入缺失）数量更多，是基于Covaris 自动声波聚焦技术DNA片段化的1.8- 2.1倍。为进一步提高NGS分析的准确性，作者开发并使用了生物信息学算法来过滤这些错误。

文章摘要

基于杂交捕获的靶向测序（NGS）在常规癌症临床实践中越来越重要。DNA文库构建是产生高质量测序数据的关键步骤，会显著影响测序数据的质量和下游分析的准确性。基于杂交捕获的测序文库制备包括多个步骤，包括 DNA 片段化、末端修复、片段化 DNA 的 A 端加尾、连接测序接头、连接产物扩增以及纯化 DNA 产物的多个纯化步骤。DNA片段化提供均匀的DNA片段分布，是大多数基于基因组DNA的短读长测序文库构建过程中的关键步骤。超声片段化和酶切片段化是杂交捕获短读长测序过程中最常用的基因组DNA片段化方法。文章中超声处理方法是通过Covaris 自动声波聚焦技术剪切DNA，可以高效、一致地产生近乎随机、无偏差的片段大小。酶法片段化在NGS中也被广泛采用。尽管最近的商品化酶法片段文库制备在很大程度上缓解了对酶切位点偏好偏差和引入测序错误的担忧，但在使用酶法片段化构建的文库中仍发现了许多意想不到的SNV和Indels。

作者平行对比了使用Rapid MaxDNA 建库试剂盒（基于Covairs 自动声波聚焦技术DNA片段化 ）以及5×WGS fragmentation mix kit (酶法DNA片段化)，制备54个不同类型实体瘤的肿瘤组织样本），并且对来自同一肿瘤样本的序列数据进行成对比较，发现基于酶法DNA片段化引入的artifact reads（主要是SNV和Indels）是基于Covaris 自动声波聚焦技术DNA片段化的1.8- 2.1倍。

图A，Covaris自动声波聚焦技术产生的SNV和Indels突变中位数为61个（范围：6-187）；酶切产生的SNV和Indels突变中位数为115个（范围：26-278），几乎为超声方法的两倍。

图B，54个样本中的绝大多数（46个）酶切产生的人为引入的SNV和indels要多于Covaris自动声波聚焦技术。

图C，测序产生的突变中，Covaris自动声波聚焦技术独有的突变种类为2599种，酶切独有的突变种类为5544种，共有的为682种。酶切特异性的突变显著多于Covaris超声。

随后作者进一步探讨了突变产生的原因。超声DNA片段化文库的大多数引入artifact reads是嵌合人为错误。其中包含基因组DNA的顺式和反式反向重复序列。相比之下，核酸内切酶处理文库的嵌合人为错误读长包含碱基不匹配的回文序列。

    在最后的讨论中，关于Covaris自动声波聚焦技术，作者谈到了两个重点：

1.     测序结果中并没有观测到之前其它文章报道的由超声引起的DNA氧化损伤导致的突变。

2.     与Covaris自动声波聚焦技术相比，酶法DNA片段化建库试剂盒通常会引入更多的SNV和Indels突变。

文章中使用的样本、试剂耗材、仪器如下：

FFPE样本：均为在某医学北京临床实验室进行NGS临床检测的样本。

FFPE样本核酸提取试剂盒：凯硕NuClean FFPE DNA kit。

Covairs 自动声波聚焦DNA片段化搭配使用的建库试剂盒：爱博泰克Rapid MaxDNA Lib Prep kit。

酶切法建库试剂盒：Qiagen的5 × WGS fragmentation mix kit。

测序Panel：求臻医学客户定制 ChosenOne NGS gene panel (∽2 Mb)（探针法）。

DNA 片段化仪：Covaris M220。

测序仪：华大智造MGI-2000平台。

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