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PacBio HiFi vs. ONT，谁才是转录本异构体测序的最强王者？
基于下一代测序(NGS)的单细胞RNA测序(scRNA-seq)技术能够以高通量的方式检测和定量基因表达，为全面了解细胞在各种生物过程中的功能提供了强有力的工具。然而，基于NGS的scRNA-seq仅量化基因表达，由于有限的读取长度，无法揭示每个基因的准确转录本结构(异构体)。而包括ONT和PacBio在内的第三代测序(TGS)技术的长读长reads使直接读取完整的cDNA成为可能，从而捕获全长转录本，对转录本异构体进行准确的表征和定量。 ONT和PacBio都已与scRNA-seq结合使用，但它们在单细胞分析中的性能尚未得到系统评估。为了解决这个问题，研究人员从含有不同数量细胞的相同单细胞cDNA文库中生成ONT和PacBio数据，以NGS为对照评估了每个平台在细胞类型鉴定中的性能。验证了两种平台在鉴定新型异构体和等位基因特异性基因/异构体表达方面的可靠性，为单细胞转录组研究中设计测序策略提供了系统评估。 1.不同测序平台生成的scRNA-seq数据的质量 作者收集了E17.5肺和脑样本进行单细胞转录组分析，将cDNA分成三组，分别进行NGS、ONT和PacBio测序。总体而言，PacBio的reads质量与NGS相当(Q30左右)，ONT的reads绝大多数低于Q20(图1b-d)。 图1.(b)三平台原始读数的Phred质量分数。(c)ONT和PacBio的全cDNA reads的Phred质量分数。(d)三平台Barcode和UMI序列的Phred质量评分。 只有大约一半的ONT reads获得了全长转录片段(Full-length transcript fragments，FLTs)，相比之下，大多数PacBio reads可以被拆分并衍生出FLTs(图2a)。对于CB（cell barcode）检测，PacBio在匹配方面优于NGS(图2b)。相比之下，ONT捕获的FLTs中含有与肺和脑样本中完全匹配的CBs不到60%。 图2.三平台数据处理的可视化评价 作者另外进行了细胞类型鉴定，发现当测序细胞数量有限时，TGS在细胞类型鉴定方面表现较好，而随着样本量的增加(如lung_5k样本)，NGS可以更有效地捕获细胞类型。且相同的细胞在NGS和PacBio之间具有更一致的细胞类型特征。虽然两种TGS技术中每种细胞类型marker基因的表达水平几乎相同，但在异构体表达水平上存在差异。在给定样本中使用NGS鉴定了一半以上的细胞类型差异表达基因(DEGs)，PacBio数据比ONT数据具有更多的细胞类型DEGs(图3f)，且在分析细胞类型特异性异构体(DEIs)时也显示出这种优势(图3g)，这表明PacBio在捕获细胞类型之间的分子多样性方面具有优势。 图3.使用ONT和PacBio识别的细胞类型DEGs和DEIs的数量 2.不同TGS平台异构体鉴定的准确性 为了评估每种TGS方法检测异构体的能力，作者根据检测到的异构体类型的数量对基因进行了排序。在两种TGS测序方法中，一些基因被检测到超过100种转录本异构体，超过1000种基因被检测到至少10种转录本异构体(图4a)。然后使用IsoQuant分析了每种细胞类型中的异构体。根据与参考序列的比对，将Reads分为一致匹配、不一致和不匹配(图4b)。在ONT数据中发现了更一致的转录本，这可能是由于使用了推荐的不太严格的处理参数。此外，作者比较了唯一注释的转录本，发现PacBio数据中每种细胞类型的完全剪接匹配(FSM)转录本的比例略高(图4c)，这表明ONT中可能存在更多剪接噪声或人为错误。且PacBio观察到的新转录本数量较多，并且在同一样本中，不同方法鉴定的新转录本具有更大的一致性(图4d)。 图4.ONT和PacBio捕获的不同转录本异构体多样性。 作者还评估了每种TGS方法捕获的新转录本异构体的准确性。随机选择在每种技术中特异性鉴定的新转录本异构体，使用RT-PCR和Sanger测序进行实验验证，证明PacBio特异性(11/15)比ONT特异性(3/14)新转录本的比例更高(图5e)，表明PacBio在识别新转录本方面具有更高的准确性。这些结果支持了TGS技术在揭示转录组景观复杂性方面的应用，突出了PacBio在新转录物发现方面的更好表现。 3.利用基于TGS的scRNA-seq技术探索等位基因特异性表达 研究等位基因特异性的基因表达，使我们能够深入研究基因表达的遗传调控机制，从而对遗传变异、个体差异、基因调控网络、进化和适应性有更深刻的认识。基于NGS的scRNA-seq很难实现这样的分析，因为一个转录序列只能捕获几十个碱基。TGS直接检测全长转录本为我们提供了进行此类调查的机会。 将两株不同的小鼠(DBA/2C和C57BL/6J)杂交取样，根据两株之间的SNP可以计算出等位基因特异性reads。通过比较两种小鼠品系的全基因组测序数据，在该基因区域共鉴定出约177万个SNP位点。与参考基因组(GRCm39)相比，PacBio样本中发现了超过12万个SNP位点。对于ONT样本获得了大约7万个SNP位点，其中70%与PacBio样本共享。因此，对于每种细胞类型，PacBio数据中更多的读取( 45%)被确定为等位基因起源，而ONT数据不到40%(图5a）。并且，与前面发现一致，PacBio比ONT检测到更多的等位基因DEGs和DEIs(图5b)。 图5.ONT和PacBio鉴定的等位基因DEGs/DEIs。 结论： 两种TGS平台具有各自的优势和不足。ONT的测序错误率要高得多，尽管已经通过将测序芯片改进到R10来提高测序质量，仍远不能准确显示scRNA-seq中的CBs和UMI。这样就牺牲了细胞所属reads测定的准确性，进一步影响了DEGs和DEIs。PacBio为cDNA文库生成的CCS数据数量有限，但采用MAS-ISO-seq策略可将15个cDNA连接到一个测序分子中，至少可以获得10倍以上的cDNA reads。尽管PacBio MAS-ISO-seq获得的FLTs仍然比ONT少，但由于分配了更准确的cDNA reads，细胞类型分析的效果更好。并且由于PacBio的测序质量更高，它在新转录本异构体鉴定和等位基因特异性基因/异构体表达的准确性方面优于ONT。 由此可见，基于NGS的scRNA-seq只能提供基因表达分析，而基于TGS的scRNA-seq在通量提升后，还可以进行基因剪接分析，鉴定出新的转录本异构体。基于TGS的scRNA-seq在通量、读取长度、准确性、成本和扩展应用方面有潜在的改进，这些进展无疑将有助于其在细胞多样性、疾病机制和许多复杂的生物过程中的应用，从而在相关领域实现更广泛的科学探索和发现。 参考文献：https://doi.org/10.1016/j.jare.2024.05.020 KINNEX试剂盒
Kinnex试剂盒基于MAS-Seq方法，可将较小的DNA片段连接成较长的HiFi可用文库，提高测序通量，使长读长 RNA -seq更具成本效益。 Kinnex 单细胞RNA试剂盒以现有的 MAS-Seq for Single Cell 3'试剂盒为基础，增加了对 10x Genomics 5'试剂盒和文库复用的额外支持。可使测序通量提高16倍，获得基因表达及全长isoform信息，在单细胞水平上揭示RNA异构体多样性。 Kinnex 全长RNA试剂盒可进行全长RNA 测序，与典型的Iso-seq文库相比，其通量提高了8倍，可实现从5'端到3'端全长异构体测序，准确表征剪接位点，发现新基因和新异构体，鉴定融合基因，并获得基因及异构体read计数信息进而分析表达量。 如果您有需要，随时联系您身边的基因人，也可以添加我们的产品经理了解详情哦~ 基因有限公司作为PacBio公司中国区合作伙伴，自2011年以来将PacBio第三代单分子实时测序技术引入国内，一直为国内用户提供专业的三代测序系统的安装培训，技术支持，应用培训与售后维护工作，赢得客户的一致好评与信任。基因有限公司将一如既往的支持越来越多的PacBio用户。 关于基因 基因有限公司成立于1992年，是一家提供生命科学科研仪器、试剂耗材和技术服务的综合服务商。基于“Gene Brightens Every Life • BioTech Connects the World”——“基因燃亮生命 • 生物技术连接世界”的愿景，专注于生命科学领域前沿技术的引进和推广，致力于推动该领域国内科研机构硬件水平及实验方案的革新与升级。同时，公司也一直致力于自主品牌的科研设备的研发与生产，拥有一系列通用性强、互补性高的自主品牌产品。 基因的服务网络遍及全国各地十多个大中城市，拥有包括仪器销售，试剂销售，市场与技术支持，维修，客服，物流等多个部门组成的完整服务体系。 我们希望通过不懈努力，为您的成功铺路搭桥，也为中国的生命科学事业赶超世界先进水平尽一己之力。欲了解更多信息，请访问www.genecompany.cn。
