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PacBio HiFi vs. ONT,谁才是转录本异构体测序的最强王者?

版权所有,转载请联系基因市场部
2024-06-07

基于下一代测序(NGS)的单细胞RNA测序(scRNA-seq)技术能够以高通量的方式检测和定量基因表达,为全面了解细胞在各种生物过程中的功能提供了强有力的工具。然而,基于NGS的scRNA-seq仅量化基因表达,由于有限的读取长度,无法揭示每个基因的准确转录本结构(异构体)。而包括ONT和PacBio在内的第三代测序(TGS)技术的长读长reads使直接读取完整的cDNA成为可能,从而捕获全长转录本,对转录本异构体进行准确的表征和定量。

ONT和PacBio都已与scRNA-seq结合使用,但它们在单细胞分析中的性能尚未得到系统评估。为了解决这个问题,研究人员从含有不同数量细胞的相同单细胞cDNA文库中生成ONT和PacBio数据,以NGS为对照评估了每个平台在细胞类型鉴定中的性能。验证了两种平台在鉴定新型异构体和等位基因特异性基因/异构体表达方面的可靠性,为单细胞转录组研究中设计测序策略提供了系统评估。

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实验结果

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1.不同测序平台生成的scRNA-seq数据的质量

作者收集了E17.5肺和脑样本进行单细胞转录组分析,将cDNA分成三组,分别进行NGS、ONT和PacBio测序。总体而言,PacBio的reads质量与NGS相当(Q30左右),ONT的reads绝大多数低于Q20(图1b-d)。

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图1.(b)三平台原始读数的Phred质量分数。(c)ONT和PacBio的全cDNA reads的Phred质量分数。(d)三平台Barcode和UMI序列的Phred质量评分。


只有大约一半的ONT reads获得了全长转录片段(Full-length transcript fragments,FLTs),相比之下,大多数PacBio reads可以被拆分并衍生出FLTs(图2a)。对于CB(cell barcode)检测,PacBio在匹配方面优于NGS(图2b)。相比之下,ONT捕获的FLTs中含有与肺和脑样本中完全匹配的CBs不到60%。

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图2.三平台数据处理的可视化评价


作者另外进行了细胞类型鉴定,发现当测序细胞数量有限时,TGS在细胞类型鉴定方面表现较好,而随着样本量的增加(如lung_5k样本),NGS可以更有效地捕获细胞类型。且相同的细胞在NGS和PacBio之间具有更一致的细胞类型特征。虽然两种TGS技术中每种细胞类型marker基因的表达水平几乎相同,但在异构体表达水平上存在差异。在给定样本中使用NGS鉴定了一半以上的细胞类型差异表达基因(DEGs),PacBio数据比ONT数据具有更多的细胞类型DEGs(图3f),且在分析细胞类型特异性异构体(DEIs)时也显示出这种优势(图3g),这表明PacBio在捕获细胞类型之间的分子多样性方面具有优势。

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图3.使用ONT和PacBio识别的细胞类型DEGs和DEIs的数量


2.不同TGS平台异构体鉴定的准确性

为了评估每种TGS方法检测异构体的能力,作者根据检测到的异构体类型的数量对基因进行了排序。在两种TGS测序方法中,一些基因被检测到超过100种转录本异构体,超过1000种基因被检测到至少10种转录本异构体(图4a)。然后使用IsoQuant分析了每种细胞类型中的异构体。根据与参考序列的比对,将Reads分为一致匹配、不一致和不匹配(图4b)。在ONT数据中发现了更一致的转录本,这可能是由于使用了推荐的不太严格的处理参数。此外,作者比较了唯一注释的转录本,发现PacBio数据中每种细胞类型的完全剪接匹配(FSM)转录本的比例略高(图4c),这表明ONT中可能存在更多剪接噪声或人为错误。且PacBio观察到的新转录本数量较多,并且在同一样本中,不同方法鉴定的新转录本具有更大的一致性(图4d)。

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图4.ONT和PacBio捕获的不同转录本异构体多样性。


作者还评估了每种TGS方法捕获的新转录本异构体的准确性。随机选择在每种技术中特异性鉴定的新转录本异构体,使用RT-PCR和Sanger测序进行实验验证,证明PacBio特异性(11/15)比ONT特异性(3/14)新转录本的比例更高(图5e),表明PacBio在识别新转录本方面具有更高的准确性。这些结果支持了TGS技术在揭示转录组景观复杂性方面的应用,突出了PacBio在新转录物发现方面的更好表现。


3.利用基于TGS的scRNA-seq技术探索等位基因特异性表达

研究等位基因特异性的基因表达,使我们能够深入研究基因表达的遗传调控机制,从而对遗传变异、个体差异、基因调控网络、进化和适应性有更深刻的认识。基于NGS的scRNA-seq很难实现这样的分析,因为一个转录序列只能捕获几十个碱基。TGS直接检测全长转录本为我们提供了进行此类调查的机会。

将两株不同的小鼠(DBA/2C和C57BL/6J)杂交取样,根据两株之间的SNP可以计算出等位基因特异性reads。通过比较两种小鼠品系的全基因组测序数据,在该基因区域共鉴定出约177万个SNP位点。与参考基因组(GRCm39)相比,PacBio样本中发现了超过12万个SNP位点。对于ONT样本获得了大约7万个SNP位点,其中70%与PacBio样本共享。因此,对于每种细胞类型,PacBio数据中更多的读取( 45%)被确定为等位基因起源,而ONT数据不到40%(图5a)。并且,与前面发现一致,PacBio比ONT检测到更多的等位基因DEGs和DEIs(图5b)。

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图5.ONT和PacBio鉴定的等位基因DEGs/DEIs。


结论:

两种TGS平台具有各自的优势和不足。ONT的测序错误率要高得多,尽管已经通过将测序芯片改进到R10来提高测序质量,仍远不能准确显示scRNA-seq中的CBs和UMI。这样就牺牲了细胞所属reads测定的准确性,进一步影响了DEGs和DEIs。PacBio为cDNA文库生成的CCS数据数量有限,但采用MAS-ISO-seq策略可将15个cDNA连接到一个测序分子中,至少可以获得10倍以上的cDNA reads。尽管PacBio MAS-ISO-seq获得的FLTs仍然比ONT少,但由于分配了更准确的cDNA reads,细胞类型分析的效果更好。并且由于PacBio的测序质量更高,它在新转录本异构体鉴定和等位基因特异性基因/异构体表达的准确性方面优于ONT。

由此可见,基于NGS的scRNA-seq只能提供基因表达分析,而基于TGS的scRNA-seq在通量提升后,还可以进行基因剪接分析,鉴定出新的转录本异构体。基于TGS的scRNA-seq在通量、读取长度、准确性、成本和扩展应用方面有潜在的改进,这些进展无疑将有助于其在细胞多样性、疾病机制和许多复杂的生物过程中的应用,从而在相关领域实现更广泛的科学探索和发现。


参考文献:https://doi.org/10.1016/j.jare.2024.05.020

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基因有限公司作为PacBio公司中国区合作伙伴,自2011年以来将PacBio第三代单分子实时测序技术引入国内,一直为国内用户提供专业的三代测序系统的安装培训,技术支持,应用培训与售后维护工作,赢得客户的一致好评与信任。基因有限公司将一如既往的支持越来越多的PacBio用户。

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