1.细胞固定

(1)甲醛的选择:建议使用16%单体新鲜甲醛固定细胞,例如CST16%ChIP级别甲醛(货号12606s)。

(2)固定时间的优化:通常建议干细胞和原代固定时间2.5分钟和5分钟,其他细 胞类型5分钟和10分钟。固定过度容易产生不易打断的大分子量染色质。

3）组织样本的建议：不同组织类型之间、相同组织的不同样品之间存在内在特异性差别，这可能造成难以获取足够的可溶性染色质供您 ChIP 实验使用。建议甲醛固定后，液氮冷冻45秒，利用组织破碎仪破碎组织。建议使用Covaris CryoPREP组织破碎仪，瞬间粉碎后进行细胞核制备，以达最大匀质化。

2.细胞裂解及细胞核制备

（1）SDS含量的影响：细胞的裂解有一步法（细胞膜和细胞核同时破）和两步法（先破膜后破核）。Covaris truChIP推荐的流程两步法采用的裂解条件较温和，其裂解液SDS含量仅为0.1%，先较低速离心破膜再收集细胞核，下游无需稀释即可直接进行IP。

3.染色质剪切

染色质剪切一般可采用自动聚焦超声（AFA）法、酶法、水浴超声和探头超声。

（1）AFA 聚焦超声：Covaris 低去垢剂体系，等温非接触，精确控制，剪切无偏好、片段长度分布可控，剪切重复性好，超声过程不升温，良好的温控保护蛋白抗原表位，提高免疫沉淀和DNA的回收率，可处理微量样本。

（2）酶法：低去垢剂缓冲体系，条件温和，成本低，但效果受酶和样本浓度及体积影响大，片段大小分布较广，过度酶可能导致非核小体区域破碎。

（3）水浴超声：缺少超声能量控制，超声能量不聚焦，大部分能量转换为热能，缺少温控，损伤蛋白抗原表位；需要高去垢剂缓冲体系；需要高超声能量，易损伤染色质，需要多次优化条件。

（4）探头超声：高温金属探头插入样本，易造成样本污染的同时也容易升温损伤蛋白抗原表位；超声过程需要暂停和加冰，重复性不好及人为操作差异大； 难处理微量样本；需要高去垢剂缓冲体系浓度SDS剪切buffer；需要高超声能量，易损伤染色质，噪音大；

4.染色质剪切片段分析

(1)超声时间摸索

(2)染色质DNA纯化：如MNG PCR产物纯化&胶回收多合一试剂盒,以获得最佳的 纯化效果。

(3)染色质片段分析：如用琼脂糖胶电泳分析DNA片段(4)染色质片段化后的核酸浓度:如果浓度偏低,可能与起始细胞量不足以及裂解过程中细胞损失有关。理想的DNA浓度应当在50~200μg/ml之间。

1.抗体选择:使用严格验证 ChIP & ChIP-seq 级抗体,获取特异 ChIP 数据。

1.将染色体从抗体/蛋白G微珠上洗脱并解交联

蛋白酶K解交联:消化染色质的蛋白质组分以及样品中可能存在的任何核酸酶,因此该步骤还可防止DNA发生降解。

2.DNA纯化

经过消化的蛋白质将对下游的DNA分析(即实时PCR、测序分析等)具有负面影响,因此需要DNA纯化步骤将其移除。推荐MNG PCR产物纯化&胶回收多合一试剂盒或者CST ChIP试剂盒里的DNA Purification Buffers and Spin Columns。

■ChIP-qPCR是用来研究已知的或者预测的某个基因的启动子是存在结合,集合的区域是哪一段。即研究者已确认要感兴趣某蛋白-DNA相互作用的靶点基因区域；

■需设计靶基因的特异引物(参考已有文献报道/使用ENCODE、UCSC和NCBI等在线软件进行预测和设计),通过引物扩增的qPCR方法定量特异基因富集水平。需注意设计的引物最好使用Input DNA检测其扩增效率 >90%；

■qPCR是非常快速,简单的验证方法,成本较低,但通量较低,适合单个或少数已知结合位点的 q-PCR 分析。

SimpleChIP® 一站式 DNA 文库构建试剂盒 & 检索引物,获取高质量的全基因组数据

ChIP-seq高通量测序分析,适用于多个未知基因或全基因组范围内的高通量研究;测序前需进行 DNA 文库构建:推荐使用CST SimpleChIP® ChIP-seq DNA 文库构建试剂盒 (#56795),搭配双端检索引物(#47538)或单端引物(#29580)进行 Illumina® 测序前的 DNA 文库构建。