香港中文大学卢煜明院士在1997年就发现了孕妇外周血中存在游离的胎儿DNA，并发展出了一套新技术来准确分析和度量母亲血浆内的胎儿DNA，被誉为“无创DNA产前检测”的奠基人。由他所开创的无创DNA产前检测（Non-invasive Prenatal Testing，NIPT）技术在人类重大出生缺陷防控领域做出了杰出贡献。目前无创产前检测在NGS测序平台上应用成熟，检测的妊娠期cfDNA多为166 bp左右的短片段。受限于NGS测序读长和检测原理，大于500bp的cfDNA片段鲜有报道。

本月，香港中文大学卢煜明院士团队在PNAS上发表了一篇文章，使用单分子测序技术揭示了母体血浆中存在大量长片段cfDNA分子。

这项工作开辟了母体血浆中长片段cfDNA分析的潜在临床效用，为单基因疾病的无创产前检测和妊娠相关疾病（如先兆子痫）的监测提供新思路。

图1 研究设计概述

在这项研究中，证实了使用PacBio SMRT测序能够从母体血浆样品中检测到来自胎儿和母体的长片段cfDNA。使用PacBio Sequel II在67×测序深度下获得320万条高质量CCS序列，其中大于200bp、500bp、1kb和3kb的cfDNA分子分别占53.7%、35.8%、22.0%和3.8%；测序得到最长的cfDNA分子有31,295bp。使用Illumina NovaSeq平台分析相同血浆样本，在8200万个双端reads中，大于 200bp和500bp的cfDNA分子分别占16.9%和1.1%，没有检测到大于1kb的分子。

图2 来自不同测序平台的母体血浆 DNA 分子的大小分布

使用PacBio SMRT测序技术对不同妊娠期母体血浆样品中长片段cfDNA的丰度进行统计。与妊娠早期和中期相比，妊娠晚期母体血浆样本的血浆 DNA 分子比例更高（大于500bp的长片段cfDNA分子的比例在妊娠早期，中期和晚期分别占15.5%，19.8%和32.3%）；与母体来源cfDNA分子相比，胎儿来源的cfDNA在大于500bp的分子比例明显减少，其中携带胎儿特异性等位基因的最长血浆DNA分子有23,635bp。

图3 来自妊娠早期、妊娠中期和妊娠晚期母体血浆样本的cfDNA 分子的大小分布

本文还通过生物信息学分析不同妊娠期母体血浆cfDNA分子末端基序谱（motif），来表征短的和长的cfDNA分子，证明了长和短的血浆DNA分子具有不同的断裂特性；进一步对来自先兆子痫妊娠的血浆DNA进行了片段大小和末端基序分析，以探寻这种妊娠相关疾病的潜在生物标志物。

PacBio SMRT测序技术以DNA聚合酶动力学反应，可特征性的判断碱基修饰，可实现全基因组范围内单碱基分辨率的甲基化分析，无需对DNA进行任何化学或酶促的转化，也无需在测序前进行PCR扩增。卢院士团队在此基础上开发了一种全基因组范围内检测5-甲基胞嘧啶的方法，也称为整体动力学（the holistic kinetic，HK）模型，确定单个血浆DNA分子的甲基化模式（即甲基化和未甲基化的胞嘧啶在CpG位点的顺序），以寻求根据其甲基化模式来推断单个长片段血浆DNA分子的来源。使用这种方法区分胎儿和母体来源的血浆 DNA 分子，其模型评估指数AUC达到了0.88。

图4 使用长血浆 DNA 分子的组织来源分析

为了验证该模型的有效性，对胎儿的母体遗传进行染色体臂水平分析和检测胎儿重组事件，以说明母体长片段血浆DNA分子组织来源分析的效用；将该方法应用于有脆性X综合征风险的妊娠无创产前检测，进一步证明了该方法的临床效用。

在本文的讨论部分，作者也表露，此前曾使用牛津纳米孔测序平台研究母体血浆DNA分子，但检测到极少数超过1kb的长片段血浆DNA（0.06 至 0.3%）其部分原因可能是由纳米孔测序的准确度较低导致。因而本文选择了读长和准确性兼顾的SMRT测序技术完成检测。

参考文献：

Yu SCY, Jiang P, Peng W, Cheng SH, Cheung YTT, Tse OYO, Shang H, Poon LC, Leung TY, Chan KCA, Chiu RWK, Lo YMD. Single-molecule sequencing reveals a large population of long cell-free DNA molecules in maternal plasma. Proc Natl Acad Sci U S A. 2021 Dec 14;118(50):e2114937118.