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2021年10月Pybus等人发表的文章“Coupling picodroplet microfluidics with plate imaging for the rapid creation of biomanufacturing suitable cell lines with high probability and improved multi-step assurance of monoclonality”使用英国Sphere Fluidics公司的Cyto-Mine®微流控单细胞分析筛选系统结合Solentim公司的Cell Metric®高分辨率孔板成像系统开发出了短时间内产生高产克隆细胞系并保证高概率和单克隆源性的新工作流程。

FujiFilm使用这一新的工作流程，进行了细胞系开发项目（9 个mAb 和1 个非mAb）。对于每个项目，电穿孔转染用于表达重组产物DHFR 的表达载体（FUJIFILM Diosynth Biotechnologies）来生成转染池。所用细胞系为CHO-DG44(FUJIFILM Diosynth Biotechnologies)。每个项目进行10 次转染，并将转染后混合物转移到75cm²T 瓶中。第二天，加入含有MTX (Sigma-Aldrich) 的新鲜培养基。首先使用Octet® Qke (Sartorius) 或酶联免疫吸附测定(ELISA) 在转染后约2周筛选瓶中的重组产物表达。使用Cyto-Mine® 对具有最高表达的五个转染池进行单细胞克隆筛选。

在转染池回收后，根据转染池表达的产物，Cyto-Mine®遵循两个优化的细胞选择工作流程：

单克隆源性Cyto-Mine®分配好的96孔板以180 x g离心5分钟，静态孵育1小时，以确保高百分比的细胞沉降到成像仪的焦平面中。在接种前一天、接种当天（第0 天）、接种后一天（第1天）以及第3天和第14天按照固定的时间间隔，使用Cell Metric® (Solentim) 明场对孔板进行成像，以稳健地跟踪单细胞衍生和随后的集落形成。

1. 第0天和第1天能看到整个孔。

2. 第0天孔内不能超过1个细胞。

3. 第1天成像时孔内不多于2个细胞。

4. 第0天时孔内无大的能遮挡孔的碎片。

图1. 快速获得生物制造用的高产克隆细胞系工作流程。多个步骤保证单克隆源性。首先，Cyto-Mine® 将单个细胞包裹到油基微滴中，后续对其基于FRET信号分选以选择高产克隆，然后将其逐一分配到96 孔板的每个孔中。每个微滴在通过分配室时都会成像五次。Cyto-Mine® 分析软件利用基于人工智能(AI) 的图像识别算法来确定每个微滴中是否存在0、1 或2 个细胞，在分配好的96 孔板上显示为热图。接下来，96 孔板在多个时间点使用Solentim公司的Cell Metric®孔板成像系统在多个时间点进行成像，以验证细胞系来自单个祖细胞。

表1. 克隆工作流程的实验得出的P(单克隆)统计数据。正态分布的第95个百分位数（α=0.05；Z1-α=1.645）与威尔逊方法一起用于计算每个单独的误差。显示的数据是十个细胞系开发项目的平均值（9 x mAb 和1 x 非mAb）。