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PacBio HiFi 测序技术突破NGS测序局限，成为分析宿主的病毒基
乙型肝炎病毒（Hepatitis B Virus,HBV）的DNA 能够整合到宿主细胞的基因组，这也是HBV的一种致癌机制。清除肝细胞中的可整合的HBV对治愈慢性HBV 感染具有重要意义，可以有效预防由于HBV引起的肝细胞癌的发生。目前可采用Alu-PCR等方法检测 HBV 整合后的片段，但通量和灵敏度都不理想。虽然可采用通量较高的二代测序进行检测，但由于测序片段短，无法充分挖掘HBV整合特征。
相比之下针对宿主的病毒基因组整合的分析，兼具读长与准确度的PacBio测序技术将成为有力的工具。
北京大学医学部陈香梅教授、鲁凤民教授等团队于2021年8月在Frontiers in Molecular Biosciences上发表了一篇名为Pacbio Sequencing of PLC/PRF/5 Cell Line and Clearance of HBV Integration Through CRISPR/Cas-9 System 的文章。在文章中，作者使用了 PacBio HiFi 技术全面的分析了人肝癌细胞PLC/PRF/5中 HBV 整合特征。 三代测序策略 PLC/PRF/5，人肝癌亚历山大细胞是一种稳定感染HBV的细胞系，能够持续稳定表达乙肝病毒表面抗原（hepatitis virus B surface antigen ，HBsAg），因而也是国际上研究乙型肝炎病毒，及其与肝癌关系的一个重要实验模型。为了在全基因组水平进行HBV整合位点的分析，作者提取了肝癌细胞系PLC/PRF/5的DNA，并采用PacBio测序，结合Canu软件进行数据矫正，在BLAST官网将HBV基因组与HBV整合后基因组进行比对，最后通过TSD软件分析HBV整合位点。 图1：分析PLC/PRF/5细胞中HBV整合的流程 测序结果 测序共获得4,142,311条cleaning reads，平均长度接近19kb。检测到其中 84条reads 出现了HBV和人类基因组的融合。这84个片段位于7条染色体上，包括chr3、chr4、chr8、chr12、chr13、chr16和chr17。通过进一步的分析，作者发现HBV整合位点附近的人类基因组和HBV DNA片段存在大量的DNA重排现象，这表明HBV整合会引起基因组的不稳定性。 图2：测序覆盖度与reads长度分布图。A：每条染色体上测序覆盖度；B：全基因组覆盖深度的累积百分比图，横坐标代表覆盖度，纵坐标代表达到这哥覆盖度水平的碱基百分比；C:Reads长度的分布图。 图2：PLC/PRF/5细胞中HBV整合模式图。红色线条代表HBV基因组，蓝色线条代表人类基因组。箭头的方向代表序列的方向，虚线代表未映射到人类参考基因组。 后续作者进一步通过CRISPR/Cas9系统，验证了三种靶向于乙肝病毒整合片段的small guide RNA（sgRNA）组合，对上清液中HBsAg的水平的抑制作用，但随之而来的促进细胞增殖的负面影响也不可忽视。 PacBio Sequel IIe — HiFi 测序技术 2020年10月，PacBio发布了最新的Sequel IIe测序平台。与之前的测序仪相比，Sequel IIe的最主要特点是可以直接生成HiFi reads，极大地扩展了SMRT测序的实用性，从而为科学家提供更全面的基因组和转录组视图。 HiFi 测序是PacBio测序平台推出的兼顾长读长和高准确度的测序技术。作为PacBio最新的数据类型，既兼顾读长(20kb的长度)又具有高准确度(>99.9%准确率)的HiFi reads，不仅可以改善变异检测，减少组装时间，还能够识别复杂的基因组区域的细微差别，有助于增加基因组组装的连续性，准确性和完整性，可以实现多倍体基因分型。 参考文献： Chen Chia Chen,Guan Guiwen,Qi Xuewei,Abulaiti Abudurexiti,Zhang Ting,Liu Jia,Lu Fengmin,Chen Xiangmei. Pacbio Sequencing of PLC/PRF/5 Cell Line and Clearance of HBV Integration Through CRISPR/Cas-9 System[J]. Frontiers in Molecular Biosciences,2021,8 长按并识别左边二维码，添加企业微信联系人HiFi reads，了解PacBio的最新资讯，还可以与我们取得在线的联系。 基因有限公司作为PacBio公司在中国区的独家代理商，自2011年以来将PacBio第三代单分子实时测序技术引入国内，一直为国内用户提供专业的三代测序系统的安装培训，技术支持，应用培训与售后维护工作，赢得客户的一致好评与信任。基因有限公司将一如既往的支持越来越多的PacBio用户。
