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科研民工破防了，原来蛋白质谱样品制备可以自动化？
蛋白质谱工作流程如今已经实现充分的标准化，可以在数百个样本中实现出色的性能，但是样本的前处理和制备仍然非常繁琐，在LC-MS之前需要进行多个蛋白质的提取、纯化和消化的步骤。
无缝式Auto SP3 AutoSP3与 Covaris AFA聚焦超声相结合，只需手动将样品板从一个板位转移到另一个板位，整个流程手动处理时间不超过5分钟。并且，LE220R-plus超声仪还可以选择与机械臂连接，以方便将样品板转移到液体处理平台，可生成一个无需手动操作的平台，每天可以处理数百个样本。适用于大规模的蛋白质组学研究，可以为几台质谱仪提供检测样品。 AutoSP3 2014年Hughes等学者建立了一种基于顺磁珠的蛋白提取方法-SP3（single-pot, solid-phase-enhanced sample preparation）（1）。在临床蛋白质组学中，高通量和精简的工作流程对于来自各种来源的样本(新鲜冷冻组织、FFPE组织或血液等)进行标准化处理至关重要。因此，Torsten Mülle等人利用SP3珠子的顺磁特性在安捷伦 Bravo液体处理机器人上实现了自动化SP3（AutoSP3），以96孔格式自动处理组织裂解物（2）。 AutoSP3能无偏好性地进行蛋白纯化和消化，并提供可由LC-MS直接分析的多肽，从而显著减少操作时间，减少蛋白质定量的可变性，并提高重复性。工作流程如下图所示： 图1 | AutoSP3 protocol 概览——从蛋白质输入到酶解以及Bravo板位设置 AutoSP3再升级 尽管上述AutoSP3具有良好的性能，但前期的组织裂解和还原/烷基化是在Bravo板外分别进行的。为了减少蛋白质组学样本制备工作流程中包括组织裂解、蛋白质还原/烷基化、清除污染缓冲成分和蛋白质消化的一系列手动处理和移液步骤，无缝地将所有这些步骤集成到自动化流程中。作者对AutoSP3进行了扩展。在工作流程中增加了一个LE220R-plus聚焦超声仪(Covaris Ltd, UK)，使用自动聚焦超声(AFA) 将高度可控和可重复的能量输送到96孔板中的小体积样本中来裂解组织、提取蛋白。 图2 | 从新鲜冷冻组织或细胞到准备注射的多肽和LCMS的整个工作流程的示意图 验证结果 作者随后验证了上述无缝式的AutoSP3流程的可行性。作者分别将100,000个Hela细胞（n=15），三种不同类型的新鲜冷冻组织 [ 猪心脏(n = 16)、小鼠肝脏(n = 16)和小鼠肾脏(n = 8) ] 各1.5-7.5 mg置于同一个96 AFA-tube TPX板中，使用含有1 %SDS的缓液，在Covaris聚焦超声仪中每轮处理8个样品，每轮耗时5分钟，96个样品总共耗时1小时。 如预期，从每种组织中提取的蛋白质量与湿组织输入物质的质量呈线性相关（图3 B），每毫克心脏组织蛋白质含量约为100ug，每毫克肝脏和肾脏组织蛋白质含量约为130ug。 蛋白提取后，将96 AFA-tube TPX板直接转移到Bravo系统中进行AutoSP3，执行包括还原、烷基化、蛋白质纯化、消化和肽回收的所有步骤。随后随机选择每个样本类型的5个重复，使用LC-MS获取蛋白质组数据。 在所有样本组中，鉴定的多肽强度高度一致，心脏、肝脏、肾脏和HeLa细胞的平均皮尔逊相关性分别为0.94、0.96、0.95和0.87（图3 C）。在每个样品类型的5个重复中，定量蛋白质的数量具有高度的可重复性（图3 D）。为了评估从组织裂解到LC-MS数据采集整个过程的处理精度，作者确定了每种样本类型的CVs，超过84%的定量蛋白质的CV < 30%，CV值中位数为13.7%(心脏)，10.4%(肝脏)，12.0%(肾脏)和15.5% (HeLa细胞)，反映出从组织裂解到生成MS数据的所有步骤的处理高度一致（图 3E）。 图3 | 将超声与autoSP3接口用于自动化组织蛋白组学。 该研究证明了AFA 超声与AutoSP3的结合是一种非常有效的方法，可以从新鲜冷冻组织中自动化地生产直接用于MS的多肽。 SP3工作原理 磁珠表面携带的羧基基团在高浓度有机溶剂的驱动下与蛋白结合，通过洗涤步骤可以去除杂质，磁珠上的蛋白在水溶液中被胰蛋白酶酶解，酶解后的蛋白/肽从磁珠可以在水溶液条件下洗脱，可以直接注射到LC-MS中进行分析（3）。 SP3特点 有效的蛋白质回收效率，在保持深度蛋白质组覆盖的同时，促进了低起始量样本应用 具有可扩展性、耐洗涤剂、速度快和易于操作等综合特性，使其成为一种通用的方法，可实现广泛的应用，包括涉及FFPE组织和陈旧骨骼等复杂样本类型的应用 其适用于低输入样本应用，例如，允许分析单个人类卵母细胞和微解剖组织 由于Covaris AFA和SP3对于各种样品兼容的特性，作者还提出将来应该进一步优化开发针对处理FFPE样品的方案， 由于组织学和WHO对肿瘤的分类几乎完全依赖FFPE，所以，利用Covaris的FFPE样本脱蜡和蛋白质提取方案完成FFPE样本的自动化蛋白质组学， 这将为几十年来收集的样本的蛋白质组分析打开方便之门。 此外，AutoSP3的低样本起始量功能和Covaris对微量样本有效处理的特性，将允许该工作流程分析小的活检组织，包括传统蛋白质组学样本处理无法获取的样本，减少活检组织的大小，以获得更特异、更多的肿瘤细胞，从而实现检测的特异性。因此，AFA超声结合AutoSP3构成了一个高度标准化的管线，有助于在数十或数百个样本的队列中识别生物学特性或临床决定因素。 参考文献： （1）Hughes, C. S. et al.Ultrasensitive proteome analysis using paramag-netic bead technology. Mol. Syst.Biol. 10,757 (2014). （2）Müller, Torsten et al. “Automated sample preparation with SP3 for low-input clinical proteomics.” Molecular systems biology vol. 16,1 (2020): e9111. doi:10.15252/msb.20199111 （3）Hughes, Christopher S et al. “Single-pot, solid-phase-enhanced sample preparation for proteomics experiments.” Nature protocols vol. 14,1 (2019): 68-85. doi:10.1038/s41596-018-0082-x 联系技术支持，获得更多资讯 基因有限公司作为Covaris公司在中国的合作伙伴和代理商，为您提供完整的质谱前处理、DNA 片段化、ChIP实验、核酸提取等解决方案。基因有限公司的宗旨是“专才为专家服务”，有专业团队为各大科研机构提供安装培训，技术支持，应用培训与售后维护一条龙服务，赢得客户的一致好评与信任。想要了解更多，请关注我们的官方微信“基因快讯”或联系您身边的基因有限公司员工。
