近日，南开大学张宏恺课题组与高诚生物医药有限公司、上海科技大学及上海交通大学合作在Science Advances期刊上发表题为High throughput functional screening for next generation cancer immunotherapy using droplet-based microfluidics的文章。

研究团队开发了一种高效的基于液滴的微流体平台，结合了慢病毒转导系统，可以对数百万种抗体进行功能筛选，以识别具有所需功能的潜在目标，这种简化的技术能够高效、客观地发现活性抗体，并显着提高筛选通量和准确性。对于开发下一代癌症免疫疗法（例如激动剂抗体或双特异性抗体）有特别重要的意义，可能会彻底改变下一代癌症免疫治疗药物的发现和开发，推进细胞间研究。

该筛选技术基于液滴微流控系统，可高通量筛选功能型抗体。将抗体基因克隆到慢病毒载体中，真核细胞被慢病毒抗体文库感染后，每个细胞仅表达和分泌一种类型的抗体；使用微流体系统将以上单个分泌细胞与单个报告细胞共同包裹在同一个微液滴中。细胞在液滴中培养过夜后，通过荧光激活液滴分选（FADS）系统，分选含有抗体分泌细胞和激活报告细胞的液滴（液滴微流控系统可以在数小时实现对数百万个液滴的生成和分选）。随后，从液滴中回收抗体分泌细胞、扩增并进行下一轮筛选；经过多轮筛选后从富集细胞中提取抗体基因进行测序，从而确定活性抗体的序列（如下图）。

使用基于液滴的微流体系统筛选功能性抗体的示意图概述

为了证明该平台的实用性，首先将其应用于发现双特异性抗体和激动剂抗体，以改善低多样性和/或低通量以及潜在偏差筛选的限制。

使用此筛选技术来确定CD40受体的激动型抗体。经过两轮筛选后，研究人员对初始文库和两轮筛选后的抗体库使用PacBio单分子实时 (Single Molecule Real-Time，SMRT) 测序技术对scFv基因测序，完成生物信息学分析。

CCS测序示意图

得益于PacBio长度长测序技术，采用环形一致性测序（Circular Consensus Sequencing，CCS） 生成HiFi reads，单条read读长可对 scFv基因进行10次以上的测序，通过软件统计可产生一条高质量CCS显著提高序列准确性。考虑到聚合酶链反应 (PCR)或测序引入的错误，将95% 相似性以上的 scFv 序列分为 561 个 scFv 簇，每个簇建立共有 scFv 序列（如下图D）。每轮细胞筛选后序列频率的比较显示，scFv 簇 C01、C03、C04、C05 和 C06，5个抗体富集程度最高，通过表达纯化和验证，发现均为CD40的强激动型抗体；而一些初始文库中比例很高的无活性抗体（scFv 簇 C02）在筛选过程中被逐轮淘汰（如下图E）。

(D) 选择过程中前 20 个 scFv 簇及其频率的条形图。(E) 在选择过程中所选抗体的频率变化。

基于该平台筛选出的CD40激动剂抗体C04，在小鼠模型中可有效激活免疫系统并抑制肿瘤生长，其安全性和有效性均媲美临床试验中最有效的CD40激动型抗体CP870893。

C04 在同基因小鼠模型中的抗肿瘤作用

随着PacBio SMRT测序技术的不断发展，更加精准而具有长度长的HiFi测序将继续在医学研究和抗体药物开发中发挥更为重要的作用。

原文链接：

http://advances.sciencemag.org/lookup/doi/10.1126/sciadv.eabe3839