开学已经一段时间了，小伙伴们的Western Blot做得都还顺利吗？

配胶漏液？

电泳跑出来条带弯曲？

条带转印不上？

不知道如何选择抗体？

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今天，小编为大家献上一些Western Blot的小Tips，愿大家都做出漂亮的条带。

配胶往往是被我们忽略的一个步骤，当Western Blot结果不好时，我们总是去考虑抗体、跑胶、转印等步骤出现的问题，但是，往往可能问题出现在配胶上面。最常见的问题就是漏胶、花胶、有气泡。当出现这些问题时，我们要注意以下操作啦！

1）每次电泳完后，洗净玻璃、胶条和其它附件。没洗干净，或者玻璃板上有杂质，容易出现气泡。

2）避免玻璃板的边缘有破损，尤其是玻璃板下缘和制胶架上的胶条接触的地方。

3）两块玻璃板的底部一定要对齐，避免一高一低，底部不在同一个平面，所以封条封不严，容易漏胶。

4）注意胶条不要老化，有裂横，如果有裂横，短期解决方式可以在胶条下面垫一层保鲜膜。

5）配置高浓度的胶时，需要选择亲和力较高的玻璃板，否则容易出现气泡。

6）夏季配胶注意温度的影响，在灌了浓缩胶之后要立即插上梳子，否则上层胶如果快要凝固，就算最后拔完梳子，上样的时候多半也会飘。如果是冬天，可以开空调，或者把胶放到37℃孵育箱里，可节省胶凝固的时间。

7）关于漏胶可以试试原位制胶的方法，玻璃板无需二次移动，操作简单。

北京百晶生物原位制胶操作视频

电泳是Western Blot条带是否好看的重中之重，只有把蛋白条带分离开，才能做后续的实验步骤。快看看你有没有遇到过以下问题吧！

1）可能是因为胶凝的不均匀，聚合的不是很好，灌胶的时候尽量混匀。

2）与梳子的插拔有关，导致凝胶孔径变化，插拔梳子时需要快速且用力均匀，冲洗加样孔的时候要小心，以免上样带扭曲。

3）样品盐浓度过高，会挤压其他条带，导致条带宽度不一。

4）每孔上样量不一致，确保每孔上样量相同。

5）系统缓冲液pH值变化导致，及时更换缓冲液。

1）“微笑”（两边翘起中间凹下）多是因为灌胶的时候冷却不均匀，中间部分冷却不好，导致凝胶中的分子有不同的迁移率所致。这种情况在较厚的凝胶以及垂直电泳时常常发生。通常解决办法是待凝胶充分凝固后再做后续实验，且制胶时注意加 APS 和 TEMED 后应该混合均匀。

2）"倒微笑”（两边向下中间鼓起）现象常常是由于垂直电泳时电泳槽的装置不合适引起的，特别是当凝胶和玻璃板组成的三明治底部有气泡或靠近隔片的凝胶聚合不完全便会产生这种现象。可在两板间加入适量缓冲液，以排除气泡。

转膜主要是将胶上的蛋白转移到膜上。膜的选择主要从实验目的和实验要来考虑。例如，要检测分子量小于20kD的小蛋白，0.45um的NC膜是不可取的，因为这样可能会使蛋白因透过膜孔而造成膜结合的目的蛋白量不确定，从而影响到最终结果的可靠性；而如果所分离的蛋白需要进行测序，则必须用PVDF膜，因为PVDF膜才能经受住严酷的清洗条件。

关于转膜封闭我们可能还会遇到以下问题，需要注意啦！

注意转膜之前，切割下来的凝胶一定要在转膜缓冲液中浸泡平衡 5-10 分钟，要含有 20% 的甲醇。

因为转膜仪使用时间太长，两块板之间的海绵由于长期使用变得很薄。

当按照阴极-海棉-滤纸-胶-膜-滤纸-海绵依次放好后两块板不能压紧，因而在胶和膜之间可能存在潜在的间隙，电转移时蛋白从胶和膜之间的空隙中流走，此时可在两块海棉之间再垫几层滤纸。另外，转膜时转膜液一定要浸没凝胶和膜，否则也可能出现上述情况。

转膜时在每一个步骤都要注意赶走气泡，确保胶和膜之间无气泡。同时转膜液要提前配置好，加好甲醇，保证转膜前液体内气泡排净。气泡存在的局部会抵抗蛋白转膜，降低转膜效率。

1）蛋白分子量太小：当蛋白分子量小于10kD时，减少转膜时间，使用小孔径的膜。

2）蛋白等电点＜9：更换更高pH的缓冲液。

3）SDS的浓度不合适：在阴极buffer中加入0.005-0.01% SDS，可提高转膜效率。

4）凝胶太厚：延长转膜时间。

1）膜没有均匀浸湿：转膜前用100%甲醇将膜完全浸湿。

2）膜或者缓冲液污染：拿出膜与吸水纸要戴手套，更换新鲜转膜缓冲液。

3）封闭不充分：延长封闭时间。

4）抗体与封闭剂出现交叉反应：检测一抗和二抗与封闭剂是否有交叉反应。

5）抗体浓度过高：适当降低抗体浓度。

1）抗体稀释比例太低：孵育时间不够，增加抗体浓度及抗体孵育时间。

2）样品中不含靶蛋白，或蛋白浓度过低：设置阳性对照或者增加样本上样量。

3）一抗二抗使用不匹配。

4）转膜不好：转膜后先用丽春红染色观看染色效果。

5）曝光时间太短：增加曝光时间。

1）二抗非特异性结果：增加一个不加一抗，其他操作不变，观察背景是否由二抗引起的。

2）一抗特异性不好：换用特异性较好的单克隆抗体。

3）蛋白质降解：提取蛋白冰上操作，加入蛋白酶抑制剂，避免样品反复冻融。

4）二聚体多聚体出现：增加蛋白质变性过程及强度。

5）抗体浓度过高：降低一抗和二抗的浓度。

6）蛋白上样量过高：降低蛋白上样量。

1）未进行非特异性封闭或者封闭不充分：一般延长封闭时间，或者换其他封闭试剂（如5%的脱脂奶粉）。

2）一抗浓度过高：降低一抗浓度。

3）抗体孵育温度过高：改为4度环境孵育。

4）膜的选择导致背景高：由于NC膜和PVDF膜与蛋白结合原理不同，选择合适的膜。

Western Blot套路重重，实验细节非常多，只有尝试去了解实验背后的原理，才能在实验出现问题时找到解决方法。希望每个小伙伴都能跑出漂亮的条带。