美国斯坦福大学和西奈山伊坎医学院的研究者，近日在《Genes》上发表了一篇文章——Phased Haplotype Resolution of the SLC6A4 Promoter Using Long-Read Single Molecule Real-Time (SMRT) Sequencing。研究人员利用PacBio SMRT 长读长测序技术对SLC6A4启动子区域的扩增子进行测序，由于该区域具有同源重复序列，以及不同表达、不同长度的等位基因，成为了一般测序技术难以解决的问题。

文章作者Botton指出，在单倍型基因组中识别启动子区域内的基因变异以及变异是否在同一对等位基因上是十分重要的。但短读长的测序不能对SLC6A4启动子中的变异进行高准确度的识别和组装，如无法获得SLC6A4基因中两个常见的多态性位点5-HTTLPR和VNTR的精确信息。并且人类基因组中的低复杂度序列和串联重复序列对于二代测序而言，也有着难以逾越的技术瓶颈。

因此，该研究团队设计了四个重叠引物，靶向SLC6A4启动子区域进行扩增，并采用PacBio SMRT测序技术对扩增子进行测序。同时研究人员还进行了Sanger测序，并收集了许多样品的短读长测序数据，比较多家技术平台的测序结果。

研究人员在各种短读长数据中发现，有3个关键变异信息或是无法识别，或是基因分型不正确。而利用PacBio SMRT技术则可以识别所有变异，包括罕见的超长等位基因上的变异。该研究团队表示：“PacBio测序技术除了在此位点上比短读长测序更准确外，还可明确地对所有样品中多态性SLC6A4启动子进行定相，包括复杂的杂合二倍体。” 而这也即是PacBio HiFi reads在单倍体分型方面所具有的巨大优势。同时，作者还对六个样本进行Sanger测序，对PacBio SMRT测序技术在变异识别的能力上进行了验证。

PacBio SMRT长读长测序可以对短读长测序缺失的区域和等位基因进行准确识别与组装，并进行定相分析。

Botton, et al. (2020) Genes.

为了评估PacBio SMRT测序工作流程的可重复性，研究小组评估了已知SLC6A4变异参考样品，并一式三份。“ 15个对照样品的组间及组内的基因型和双倍型一致性均为100％。”

研究人员指出，高精准的PacBio SMRT长读长测序技术，可以实现对复杂的SLC6A4启动子二倍体进行定相分析，而这是短读长测序技术进行全基因组测序，或是基于靶向富集技术，进行更高深度短读长测序所无法完成的。在文章中， 研究人员们也对PacBio测序技术在SLC6A4启动子区域进行测序的优势，给与了充分的肯定。

如今，随着PacBio SMRT测序技术的不断发展，酶读长的进一步提升，更加精准而具有长读长的HiFi测序将能够在人类基因组的研究与发现中扮演更为重要的角色，在过去的一年中，我们也欣然看到基于这一技术，我们对肿瘤药物、遗传肾病、乳腺癌致病基因发现等有了更清晰的认识。想必在不久的将来，这一技术也将更为广泛的造福于人类医学的相关研究。

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