百因必有果，磷酸化蛋白WB检测请找我

而磷酸化的蛋白在蛋白磷酸酶的作用下又可以去磷酸化，整个过程是可逆的。

蛋白质的磷酸化和去磷酸化是可逆性调节蛋白质功能的重要方式，几乎涉及所有生理、病理过程，如细胞的生长发育、基因表达与调控、神经递质的合成与释放，甚至细胞癌变等[1]。通过蛋白质的磷酸化与去磷酸化，细胞控制着信号的传递过程，进而影响细胞的生物学效应与功能，在生命活动中发挥着重要作用。

在进行蛋白质磷酸化Western Blot分析检测时，需要同时检测磷酸化蛋白水平和该蛋白的总水平，但两者分子量差距很小，使用化学发光方法进行检测时，需要先使用磷酸化蛋白抗体进行孵育、检测，之后进行剥离，再重新孵育该蛋白的抗体进行检测。

既然化学发光Western Blot检测法检测磷酸化蛋白这么麻烦，那有没有什么方法可以实现磷酸化蛋白快速便捷的检测呢？

LI-COR公司的Odyssey 双色近红外荧光Western Blot检测方法使用不同荧光基团标记的二抗，即可同时检测磷酸化蛋白水平和该蛋白的总水平，因为无需进行剥离及再孵育，缩短了磷酸化蛋白检测的时间，实现了高效便捷的磷酸化蛋白水平和该蛋白的总水平检测，同时蛋白定量更为准确。

1.化学发光和近红外荧光Western blot流程时间对比表

从上图1中，可以看出LI-COR odyssey 近红外荧光Western Blot法同时检测磷酸化蛋白水平和该蛋白总水平的时间比传统化学发光Western Blot方法节约了将近4个小时，节省了化学发光Western Blot法剥离和重孵育膜所需要的时间。

近年来关于用LI-COR Odyssey 双色近红外荧光进行磷酸化Western Blot蛋白检测的文献越来越多，备受杂志的推荐，其中一篇《Quantitative Evaluation of Signaling Events in Drosophila S2 Cells》[2]的研究较为典型，其结果如下：

图2.JNK磷酸化作用对LPS刺激应答的时间进程

图(A,B) LI-COR Odyssey 双色近红外荧光Western Blot检测经LPS处理的S2细胞中总JNK蛋白和磷酸化JNK蛋白(p- JNK)的含量。裂解产物分别用抗p-JNK(A)和抗JNK (B)抗体检测。分别用Alexa-fluor 680和Alexa-fluor 750标记的二抗进行检测。图A和B均为伪彩，叠加后得到图（C），总JNK蛋白为红色，p-JNK蛋白为绿色，蛋白分子Maker在第9泳道。（D）对A中p-JNK蛋白水平相对于B中总JNK蛋白水平在每个时间点进行定量和归一化；p-JNK蛋白/总JNK蛋白的比值，在LPS处理0min时比值赋值为1,其他时间点的比值显示相对于这个赋值的结果如图所示。

文献中还提到，定量WB检测依赖于LI-COR Odyssey 近红外成像系统，该系统在相对定量蛋白样品方面具有明显优势。近红外成像系统可以在一张膜上检测多重蛋白，不需要剥脱和抗体再孵育。通过带有不同波段近红外荧光标记的二抗可以分别检测磷酸化和总蛋白的一抗，节省磷酸化蛋白检测时间和简化操作步骤。