您的分子生物学实验开始了吗？

限制性内切酶是分子生物学实验中必然会用到的一类工具酶，用起来很简单，但似乎又有很多不太明白的地方。今天基因小编与您聊一聊百度百科中没有写的，关于限制性内切酶的那些事。

酶是一种催化剂，用来衡量其催化活力大小的标准即酶活力单位。不同的酶催化能力有高有低，因此不适合使用酶的物质的量或质量来衡量。NEB的限制性内切酶活力单位一般定义为在1小时内切开1μg lamda DNA所需要的酶量。因此，当增加的底物DNA的量时，要么使用更多的酶以达到在1小时内完全切开的效果，要么使用等量的酶但延长酶切时间。其他的酶，如连接酶、聚合酶的酶等，酶活力单位的定义在处理的底物总量、反应时间上有所不同。

大多数常用的限制性内切酶的最适反应温度是37度。尽管经过改造，部分酶仍然需要更高或更低的温度，例如BsmBI-v2需在55度进行反应，在37度下只有10%的活力；而SmaI则只能在25度进行反应，处于37度时活力下降50%，且半衰期只有15分钟。因此在使用限制性内切酶之前，请看准反应温度，以免造成不必要的损失。顺便一提，尽管有些酶的性能表现很好，但是其无法在37度下具有完全的活力，因此未能入围NEB星选酶大名单。

限制性内切酶必须在一定的盐离子、pH下才能正常发挥催化活性，这种反应环境由缓冲液提供。购买NEB的限制性内切酶时，会随酶赠送最适合的反应缓冲液，如有需求也可单独购买。NEBuffer是NEB提供的缓冲液的统称，在限制性内切酶中主要包括Cutsmart buffer、NEBuffer1.1、2.1和3.1四种，极少数酶有自己专用的缓冲液，例如NEBuffer SspI可为SspI提供最适条件。其中Cutsmart buffer是使用最广泛的一种缓冲液，可以为216种限制性内切酶提供最适反应条件。10X表明该缓冲液是以10倍浓度存储的，所以在配制反应体系时只需加入总体积的1/10，即反应液的终浓度为1X NEBuffer。

在非标准反应条件下，一些限制酶能够切割与其定义的识别序列相似但不相同的序列。这种改变的特异性被称为“星活性”，有人提出星型活性是限制性内切核酸酶的一般特性，任何限制性内切核酸酶都会在某些极端条件下切割非规范位点。

当反应体系中的甘油浓度过高（>5%  v/v）时，星活性容易出现。而限制性内切酶一般存储在50％的甘油中，因此添加的酶量不得超过总反应体积的10％。此外，使用标准的50 µl反应体积有助于减少孵育过程中的蒸发带来的甘油浓度变化。

浴能完全包覆离心管底部，因此可以更有效地进行热传递，所以经温度计校准过的水浴锅是最佳孵育选择。金属浴的孔槽可能无法与离心管底部完全贴合，此时二者间的缝隙可能阻碍热传导，导致管内的反应液无法在孵育足够长的时间，从而出现酶切不完全的现象。使用PCR仪进行孵育时，建议关闭热盖，或将热盖温度设置地与反应温度接近。切勿使用恒温培养箱进行孵育。