大脑的空间结构与其功能密切相关。这种结构-功能关系在人类大脑皮层的层状组织环境中尤其明显，其中位于不同皮质层的细胞表现出不同的基因表达模式，并表现出不同的形态、生理和连通性模式。人类神经元相对较大且脆弱，再加上大多数是用人死后冰冻的脑组织，导致人脑中几乎所有可用的数据都是通过snRNA-seq方法在分离的细胞核上产生的。而该方法的局限性是分离的细胞核缺乏细胞质、轴突和近端树突，这限制了研究者对胞浆和神经管中基因表达的理解。另外单分子荧光原位杂交（smFISH）技术对以及较新的激光捕获显微切割测序技术对研究大脑都有一定的限制及不足。全基因组空间转录组学克服了scRNA测序和基于显微镜的空间转录组学方法的局限性。重要的是该技术采用载玻片cDNA合成方法，捕获完整组织结构中的基因表达，这意味着胞浆和神经元过程中的信息得以保留。为了进一步了解人类皮层空间组织中的基因表达，作者使用了最近发布的10x基因组学Visium平台，这是一种基于条形码的转录组全空间转录组学技术，建立成人大脑背外侧前额叶皮质（DLPFC）基因表达的空间图。

作者选了三个独立的成年捐献者的脑组织分析了其死后DLPFC组织切片中的空间基因表达。每对DLPFC组织切片由两个直接相邻的10µm连续组织切片组成，第二对与*对切片相隔300µm，因此总共有12个张切片进行分析。人背外侧前额叶皮层（DLPFC，一种与许多神经精神疾病有关的大脑区域）进行10x Genomics Visium空间转录组测序，绘制DLPFC基因表达的层状图谱，并利用已发表的大规模snRNA-seq研究数据增强注释。通过整合神经精神障碍基因集，作者展示了精神分裂症和自闭症谱系障碍相关基因的差异层富集表达，突出了空间限定表达的临床相关性。最后，开发了一个数据驱动的框架来定义空间转录组数据中的无监督簇，它可以应用于那些形态结构没有皮层层那么明确其他组织或大脑区域。

DLPFC的基因表达

对整个空间重复的每一层的每个基因的UMI数总和生成layer-enriched表达谱来进行 pseudo-bulked处理，得到12个样本中的47,681个点汇总到76个分层聚合的基因图谱中， 消除了稀疏性并大幅增加了基因的UMI覆盖率。层富集表达谱的无监督聚类揭示了与皮层差异相关的数据变化的主要成分，尤其是白质和灰质之间，而在每对空间重复样本中一致性高。作者使用3种Layer-level基因建模（ANOVA、Enrichment和Pairwise）方法来进行差异基因分析，经一系列数据分析比较得出成年人DLPFC不同层之间广泛的基因表达差异。

鉴定人类皮层中新的层富集基因

之前也鉴定出了些Marker基因，但这些研究使用了不同的技术，检测了不同的发育阶段，并在大脑皮层的不同区域。因此，作者在成人DLPFC层富集基因表达数据集中系统地评估了这些先前确定的标记基因的稳健性。例如：CUX2在第2层高表达，CCK在第1、2、3、4、6层高表达等。本研究中还找到了新的 layer-enriched 差异表达基因，例如：AQP4在第1层高表达，HPCAL1在第2层高表达等，并利用RNAscope smFISH进行验证。

层富集基因表达谱的临床意义

考虑到一些研究已经确定了不同的大脑疾病和分子定义的细胞类型之间的联系，使用几种不同的脑疾病相关基因集来评估空间基因表达的临床相关性。分别选取DNA研究的不同混乱疾病相关的基因集、各种脑疾病患者和正常人的死后大脑中差异表达的基因集和全转录组关联研究(TWAS)的遗传风险相关的基因集，证明了ASD和SCZD（神经分裂症障碍）中涉及基因的优先层富集表达。例如，发现第2层和第5层高表达的基因与ASD高度相关;而SCZD相关的基因在L5中优先表达。