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蛋白得率低、活性差、降解严重？看这里！
但是尝试传统水浴超声或者是探头超声的同学们可能还是遇到了超声后蛋白出现降解的情况，是什么原因导致的呢？从下图Covaris AFA与常见破碎方式在处理样本时的温度变化比较中我们可以看出，与传统的水浴超声和探头超声相比，达到同样的破碎效力，Covaris AFA产热更低，耗时更少。而传统超声如水浴超声当剪切力到达2MPa，处理600s时,样本管温度由原来的4℃升高到25℃。这个不易察觉的温度升高，往往造成了蛋白的降解。 Covaris AFA样本处理系统。与所有传统的基于超声的样本处理方法不同，Covaris采用聚焦超声技术（AFA），仪器与样本不进行直接接触，球型换能器产生超声聚焦作用于样本，能量利用率极高，方向和力度精准可控，处理重复性好。仪器功率低，效率高，整个系统无过多热能产生，温度不易失控。 AFA助力样本制备 1. AFA 提取保留蛋白完整性提高蛋白得率 许多已发表文章都认可了AFA技术提取能提高蛋白得率，并且帮助蛋白质保持在自然状态，保留蛋白完整性。这对于研究翻译后修饰(PTMS)，如磷酸化、泛素化或蛋白活性测定非常有帮助。 来看个实例。分别使用Covaris AFA聚焦超声法、珠子研磨法和探头超声法，对酵母菌液进行破碎裂解，每种方法均使用两种功率。对三种方法提取得到的蛋白样品进行浓度、磷酸酶活性，SDS-PAGE分析。 Fig.1 使用自适性聚焦超声（AFA）、珠子研磨、探头超声分别裂解酵母菌液，总蛋白得率（上）和磷酸酶活性（下）。 对上述三种方法提取的总蛋白样品进行SDS-PAGE分析，结果如下图所示： Fig.2 自适性聚焦超声（AFA）、珠子研磨、探头超声分别裂解酵母菌液，得到的总蛋白SDS-PAGE结果。 从图2中可以看出，AFA 处理的酵母细胞提取的总蛋白中25~75 kD之间的高分子量蛋白丰度明显高于珠子研磨法及探头超声处理的样本，同时25kD 以下的低分子量蛋白峰度明显低于另外两种方法处理的样本。值得注意的是，虽然探头超声MAX 处理条件下的总蛋白得率及磷酸酶活性与AFA 处理结果相当，但是通过SDS-PAGE 结果我们不难发现，探头超声MAX 处理条件造成了严重的蛋白质降解，这种样品将严重影响后续的western blot、双向电泳以及蛋白质谱的结果以及分析的准确性。 将上述样品进行双向电泳分析，结果如下图所示： Fig.3 自动聚焦超声（AFA）、探头超声、珠子研磨（minimum&maximum speed）裂解酵母菌液，得到的蛋白样品，使用2-DE双向电泳分析。 2-DE结果显示使用AFA处理的蛋白样本中保留了更多高分子量蛋白。 因此，Covaris自适性聚焦超声（AFA）技术应用于蛋白提取，提高总蛋白的得率和活性，保护高分子量蛋白的结构完整性，保留蛋白质的泛素化、磷酸化等修饰位点。 2. AFA可以进行低起始量提取 在蛋白质研究当中，常遇到低起始量(细胞数<10，000)）。AFA提供的精确可控聚焦声波技术提高了细胞裂解效率，帮助高效从低起始量样本中提取蛋白质、RNA、DNA、代谢物或其他目的产物。 使用Covaris AFA聚焦超声技术对重悬于15ul 25mM 碳酸氢铵溶液中的2000个细胞进行裂解处理，并与常规方法使用8M尿素进行普通超声后得到的蛋白质谱结果进行比较（上样量等同于500个细胞，结果如下）。 Fig.4 2000个细胞分别用In-solution、On-tip、AFA技术和10^7个细胞使用常规裂解方法提取获得的匀浆产物，上样其中500个细胞的蛋白产物进行PLOT-LC-MS串联质谱鉴定的结果(n=3)，细胞为MCF-7细胞。 从上图中可以看出，AFA方法处理2000个细胞所得的蛋白质种类远远高于其他两种常规方法，同时经AFA处理后，在不使用变性剂的情况下AFA技术的处理可以有效的进行样品破碎，即使2000个细胞所得的蛋白质种类与常规裂解方法处理1X10^7个细胞所得蛋白质种类相当。此外，使用Covaris AFA聚焦超声技术处理的细胞可以在一管内完成还原、烷基化及酶解，所得肽段溶液可以直接进行质谱上样，无需脱盐处理，减少样品损失的同时大大缩短实验时间。 4. AFA提取蛋白种类更多更丰富 Fig.5 标准方法和Covaris AFA技术分别用于LC-MS前的胰蛋白酶消化，质谱结果展示 结果显示，在质谱前的蛋白样本消化过程中使用Covaris AFA技术，质谱分析出的肽段的种类（横坐标）和丰度（纵坐标）完胜常规方法。 5.从FFPE样品中提取蛋白质 FFPE样本是临床样本的最大来源之一。传统上，由于低效、不完全的石蜡去除和解交联，FFPE样本一直存在蛋白质回收效率差、重复性差、速度慢等问题。Covaris AFA技术和Protifi™s-™的独特组合可在单管单柱中快速简便高效的提取FFPE样本蛋白质，提高蛋白质得率和获得的蛋白质种类数，同时具有高度可重复性，无需有毒有机溶剂，此外也易于高通量扩展。 Fig.6 SDS/AFA/S-Trap workflow for FFPE samples Fig.7 AFA+5%SDS+Protifi S-Trap蛋白提取方法与研磨珠提取得到的蛋白质种类比较，样本为肾脏FFPE样本。 从上图可以看出使用5%SDS +研磨珠+Protifi S-Trap提取肾脏FFPE样本得到581种蛋白，而采用AFA+5%SDS+Protifi S-Trap蛋白提取方法则鉴定出2508种蛋白，远远高于采用研磨珠的方法。 6. AFA可处理难裂解样本 AFA超声技术已被证明对多种样本的裂解是有效的：植物、细菌、酵母或肌肉等坚硬的哺乳动物组织已经成功地用聚焦超声处理过。 Covaris 为您提供完整优化的蛋白质提取解决方案 Covaris针对不同的下游实验，开发出不同的protein extraction buffer。无论是天然蛋白还是变性蛋白，从仪器到试剂给您一个完整优化的蛋白质提取方案。 Fig.8 Covaris蛋白提取buffer选择表 Covaris truXTRAC Proteins-Tissue Lysis Buffer(520284)适用于FFPE样本、新鲜/冷冻组织、细胞等样本类型的蛋白提取。 如需了解更多，欢迎扫码咨询 基因有限公司作为Covaris公司中国区独家代理商，为您提供完整的DNA 片段化、ChIP实验、FFPE样本核酸提取、蛋白提取解决方案等。基因有限公司的宗旨是“专才为专家服务”，有专业团队为各大科研机构提供安装培训，技术支持，应用培训与售后维护一条龙服务，赢得客户的一致好评与信任。想要了解更多，请关注我们的官方微信“基因快讯”或联系您身边的基因有限公司员工。
