PacBio的单分子实时（SMRT）测序技术经过多年的发展，已经使酶读长度增加到平均100 kb。通过优化和平衡酶读长与插入片段的长度，开发了一种基于CCS（Circular Consensus Sequencing）的高准确率长读长测序模式——HiFi Reads。能够在提供长读长reads（10-20kb）的同时兼顾准确性（Q30，99.9%准确率）。HiFi Reads的生成原理请参考下面动图。

图1：PacBio HiFi Reads的生成原理

点击链接，了解有关PacBio HiFi更详细的内容：Nature Biotech文章验证了PacBio HiFi Reads进行基因组组装及变异检测的出色性能

由于此次PacBio HiFi reads，来自于作者采用过短的11 kb插入片段来构建的文库，在组装的结果中，相较而言Nanopore ultralong reads在组装具有更强的连续性。

在2019年Sequel II系统正式面世后，基于Sequel II平台的相关试剂、软件都有了更进一步的提升。目前在Sequel II上，能够支持的HiFi文库构建已经扩大至20 kb。更大的插入片段构建的文库，更大程度的兼顾了PacBio超长读长的发挥，以及高度准确性。无论是跨越重复序列，还是序列中微小的差异，甚至是那些位于重复序列中的微小差异都能够很好的识别。事实上，在比水稻基因组更大的物种，例如玉米（2.5 Gb），燕麦（11 Gb）中，这一优势已经已经得到了证实。甚至，四倍体玫瑰（600 Mb x 4）的基因组组装也可以通过HiFi reads得到基因组中等位基因准确的单倍型结果。

表1：HiFi reads在大型基因组中的应用表现

图2：HiFi reads组装四倍体玫瑰基因组

您可以点击文末的“阅读原文”，了解2020年PAG大会上四倍体玫瑰基因组的报告分享

在bioRxiv预印网站该文章的下方，社交平台对文章的讨论中，来自PacBio的专家Elizabeth Tseng也提出，以文章中采用的11 kb来进行HiFi reads的组装分析，往往是不够的。通常需要15 kb以上的文库，才能更好的解决重复序列的问题。这一观点也得到了不少学者的认可。

另一方面，由于HiFi reads已经完成了单分子的纠错，因此在组装过程中可以大大简化流程，与CLR（Continuous Long Read）模式相比，可大大节约组装所消耗的时间。并且，还可以支持等位基因单体型的组装。上述提到的四倍体玫瑰项目，就获得了不同单倍型的准确结果。另外，目前，也已经有不少针对HiFi reads开发的基因组组装软件，包括HiCanu，Hifiasm，补充了HiFi流程的Falcon等等，都可以作为基因组组装分析的优选工具。

在bioRxiv预印文章的讨论区，PacBio资深专家Armin Töpfer 博士向作者推荐了更新版本的Canu。有关如何使用HiCanu，也可以参考下方链接中的内容。

https://github.com/marbl/canu/issues/1601

PacBio HiFi reads在数据量的产出方面，经过2019年2.0版本试剂的升级，一张SMRT Cell 8M芯片更高可产出500 Gb的数据，经CCS分析后，可获得超过25 Gb准确率在Q20以上的数据，用于更准确的组装分析。相对于原来的CLR方式，HiFi reads的覆盖深度也有可降低，在15-20X左右即可获得高质量的基因组组装结果。因此，即使对于本文所采取的水稻作为研究对象，一张SMRT Cell 8M芯片即可完成高质量的基因组组装，并能够对基因组中包括SNP及结构变异在内的所有变异进行检测。

综合以上内容，不难看出。目前已经可以采用更优化的手段运用HiFi reads来进行基因组的组装与分析。无论是在分析软件的选择，还是数据产出与成本控制方面，已经有了大幅的改善。目前20 kb的文库插入片段，已经可以更加完美的兼顾读长与准确度。相信对于绝大多数研究领域而言，PacBio HiFi reads带来的更为准确度的基因组组装结果，将会是进行更深入研究的良好基础。

参考原文：

Lang, Dandan, et al. "Comparison of the two up-to-date sequencing technologies for genome assembly: HiFi reads of Pacbio Sequel II system and ultralong reads of Oxford Nanopore." bioRxiv (2020).