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NanoDrop助力qPCR模板质控
qPCR检测新冠病毒
2020年伊始，新冠疫情来势汹汹，根据国家卫健委发布的《新型冠状病毒肺炎诊疗方案（试行第6版）》中要求，实时荧光定量PCR技术（qPCR技术）是新冠病例确诊的主要方法，各地疾控中心及定点医院都在利用qPCR技术对SARS-CoV-2进行检测，从而更有力地帮助新冠疾病的诊断。 众所周知，qPCR技术在病原菌、病毒微生物的鉴定、基因表达分析等方面有着广泛应用，具有检测速度快，灵敏度高和特异性好等特点。但做好qPCR则绝非易事，从核酸抽提到更后的检测分析有许多小细节需要注意，其中，对qPCR模板做好质控尤为重要。根据实时荧光定量PCR国际化标准——MIQE指南要求，在进行qPCR前需要对样本核酸进行质控，主要包括核酸定量和纯度的质控。 01. 核酸样品定量质控 对于绝对定量，样品浓度必须在标准曲线范围内。标准曲线的线性是有一定范围的，如图1进行实际检测时，模板浓度过高或模板浓度过低时，均不在标曲的线性范围内，检测结果不准确。因此，在进行qPCR 前更好确认样品在合适的浓度范围内。 图1 对于相对定量，样品浓度过低会增大实验的系统误差。如图2所示，与正常浓度样本相比，低浓度样本进行检测时，Cq值变化较大，数据离散程度大，重复性差，存在一定的实验误差。 图2 02. 核酸样品纯度的质控 在核酸提取过程中残留的污染物会干扰浓度检测的准确性，容易对下游实验分析如qPCR结果等产生较大影响。核酸中常见的污染有蛋白、苯酚和胍盐的污染等，传统判断污染物类型方法是看A260/A230以及A260/A280的比值。单纯依靠比值很难判断是何种污染物，将纯度比与检测光谱结合，可以帮助实验者提高对污染物判断的准确性，但是需要实验者在光谱判别上有丰富的经验，且即便判断正确，实验者也无法估计样本中真实的核酸浓度是多少，如图3、图4所示。 图3 图4 这时，具有污染物鉴定分析功能的Nano Drop One优势尽显，ND One不仅可以给出核酸检测的光谱图，给出A260/A230与A260/A280的比值，还具备污染物鉴定和校正功能，无需实验操作者丰富的经验判断，就可以直接给出存在什么污染，并准确给出扣除污染物后的校正核酸浓度值，如图5。 图5 因此，通过Nano Drop One做好核酸样品定量和纯度的质控，不仅可以帮助实验者提高qPCR检测成功率，还可以大量节省qPCR反复检测中的时间和金钱消耗。如不进行严格质控，不仅会造成格外的人力财力物力损失，更甚者会耽误疾病诊断的更佳时机。 qPCR检测细节千万条， NanoDrop质控条。 NanoDrop One/Onec为NanoDrop 家族新一代产品，延续NanoDrop一贯的精准与稳定，增加Acclaro智能样本检测技术，可实现污染物样本自动报警，污染物鉴定，污染物结果校正等，进一步解决科学研究者的实际问题。
