文中提到：抗体质量的好坏在Western Blot的重复性问题上起关键的作用，抗体表现不稳定会极大影响Western Blot结果或其他免疫学实验结果。而由于当前缺乏对抗体验证、以及文献中提交实验细节的执行标准，导致重复性问题更严重。

    这个问题期刊杂志也非常关注，2016年，国际抗体验证工作组（IWGAV）（2）的提出改进抗体使用和验证标准的指南（3）；更近，美国国立卫生研究院（NIH）发布了新的赠款提交准则，要求调查人员描述他们将如何“确保身份和关键生物资源的有效性”，包括抗体（NOT-OD-18-228）；国际社会也提出一个名为“关于蛋白质亲和试剂（MIAPAR），旨在建立一种抗体生产者和使用者之间的联系更加紧密；而且一抗的性能表现很容易受实验环境的影响，所以建议针对每一种免疫学实验设计并进行针对性的抗体验证。

抗体供应商要提供每种抗体的相关数据：抗体来源（多克隆，单克隆或重组）；是否已纯化；使用的免疫原类型；测试裂解物；稀释液，样品浓度；货号/批次等信息）， 理想情况下，还应该提供来自多个细胞系/组织特异性Western Blot验证的数据，阳性和阴性对照数据。

  文中提到：抗体质量的好坏在Western Blot的重复性问题上起关键的作用，抗体表现不稳定会极大影响Western Blot结果或其他免疫学实验结果。而由于当前缺乏对抗体验证、以及文献中提交实验细节的执行标准，导致重复性问题更严重。

  Western Blot重复性问题期刊杂志也非常关注，2016年，国际抗体验证工作（IWGAV)^（2）提出改进抗体使用和验证标准的指南^（3）；国际社会也提出一个“关于蛋白质亲和试剂（MIAPAR）的提案，旨在建立一种抗体生产者和使用者之间更加紧密的联系；另外一抗的性能表现很容易受实验环境的影响，所以文章建议针对每一种免疫学实验设计并进行针对性的抗体验证。

  抗体供应商要提供每种抗体的相关数据：抗体来源（多克隆，单克隆或重组抗体）；是否已纯化；使用的免疫原类型；测试裂解物；稀释液；样品浓度；货号/批次等信息），理想情况下还应该提供来自多个细胞系/组织特异性Western Blot验证的数据，阳性和阴性对照数据。

01

对于用户而言：不管抗体供应商有没有提供以上信息，用户也要对抗体进行验证，原因在于不能保证购买的抗体在用户端的实验中、对用户感兴趣的目标蛋白具有特异性。实验中的其他条件例如使用不同类型的封闭液也会对抗体的表现会产生影响。

Figure 2：不同类型封闭液对cofilin一抗性能的影响

02

  使用合适的阳性对照和阴性对照对抗体的特异性和专一性进行验证。

阳性对照：阳性对照的结果正常，就表明整个实验体系、流程正常有效；反之整个实验体系、流程异常。

阴性对照：文中提到knock out (KO)和knockdown (KD）的细胞系/裂解液/组织是很好的阴性对照。RNAi-KD样品作为KO的替代品也可作为阴性对照（关于KO ,KD, RNAi-KD局限性详见原文）。

03

  选择经过预吸附处理的抗体，经预吸附处理的抗体特异性更强。

  对抗体的稀释度、浓度进行验证优化

04

  多重Western Blot检测以及抗体验证

  未来Western Blot检测的趋势是尽可能高通量地检测目标蛋白，而多重Western Blot可满足这个要求。

  多重荧光Western Blot检测：允许在同一张膜上同时检测两种以上目标蛋白，不需要Stripping和Reprobing同时也避免了Stripping和Reprobing造成的假阳性和假阴性。LI-COR Odyssey Clx双色红外激光成像系统就可实现多重荧光Western Blot成像，重复性更好，定量更准确。

  多重Western Blot检测中的抗体验证

对一抗和二抗进行验证以确认交叉反应是否影响Western Blot结果。

(1)首先在相似的实验条件下进行一抗的验证：将两种一抗混合后孵育进行Western Blot;

将两种一抗分别孵育进行Western Blot以验证是否有潜在的交叉反应或者干扰。

(2)二抗：可以通过识别不同的抗体种属对二抗进行验证。

Figure 7:PARPA1经星形孢菌素（STR）处理发生降解的多重近红外荧光Western Blot分析结果

备注：PARPA1经(STR)处理后会降解成85KD和25KD的两条条带，该实验在同一张膜上进行多种不同蛋白抗体特异性的验证；

泳道2、泳道3样本未经STR处理；泳道4、泳道5样本经过STR处理；

A: 近红外荧光800nm通道：泳道2（未经STR处理的HAP1 WT样本），一抗ab32138在130kDa位置检测出全长PARP1蛋白 ；泳道4（经STR处理的HAP1 WT样本），一抗ab32138在130kDa位置检测出信号稍弱的全长PARP1蛋白，以及在28kDa位置检测出PARP1降解后N端条带(PARP1 p25)；

B: 近红外荧光700nm通道，泳道4（经STR处理的HAP1 WT样本），一抗ab110315在85kDa位置检测出PARP1降解后C端条带（PARP1 p85）,在未经药物处理Control以及HAP1 PARP1KO样本中未检测出条带；

C：近红外荧光700nm通道和800nm通道merge图像，清晰地检测出全长PARP1以及经STR处理后降解成85kD 、25kD两条条带。

以上Western Blot结果均在LI-COR Odyssey CLx近红外荧光成像仪上进行成像

实验更多详细信息详见原文

05

蛋白翻译后修饰研究（例如磷酸化修饰）中抗体验证的总原则：

（1）目标蛋白总水平和目标蛋白翻译后修饰水平分别进行Western Blot以验证抗体的特异性；

（2）对目标蛋白总水平和目标蛋白翻译后修饰水平的一抗分别用错配的/相反的二抗孵育进行Western Blot;

（3）在特定实验条件下（例如药物处理）导致发生蛋白翻译后修饰，在上述条件下对目标蛋白翻译后修饰水平的一抗进行验证；

（4）任何新的目标蛋白总水平和目标蛋白翻译后修饰水平的一抗，要设计多重Western Blot和两种蛋白单独实验进行抗体验证；

......

更多详细内容请点击文末链接查看原文

备注：

在此文中共涉及Abcam 15种以上的一抗；

在此文所有的近红外荧光Western Blot结果均在LI-COR Odyssey CLx双色红外激光成像系统进行成像，并用LI-COR的ImageStudio 5.2版本的软件进行数据分析。

抗体验证是一个复杂的过程，目前还没有明确/建立统一的国际标准，但是希望每一个研究人员都可以为提高重复性贡献自己的一份力量，例如：提交包含实验和抗体验证相关的所有细节信息，杂志要求时提供原始数据，将验证方法和验证数据保存在已有数据库中，将抗体使用信息反馈给供应商等。抗体供应商应继续严格进行质量控制和验证，出版商也应继续加强对文章发表的要求，文章强调希望大家共同克服当前的抗体重复性危机，促进技术的发展。

LI-COR Biosciences公司作为近红外荧光成像的创始者和领导者，在近红外荧光成像领域已有25年的丰富历史，是名副其实的近红外专家。

25年来，LI-COR Odyssey ®双色红外激光成像系统由于可实现Western Blot精确定量，进行多重Western Blot，提高重复性，得到了全球生物医学研究人员的信赖。

极其丰富的应用