自去年12月底武汉地区暴发的“不明肺炎”，中国疾控联合专家组上周宣布初步判定是由新型冠状病毒引起。1月12日，上海公共卫生临床中心联同多家研究机构在virological.org、基因库网站GISAID联合公布了其中一个武汉不明肺炎感染个案的基因排序。

    测序技术的发展为病毒准种的研究提供了新的途径。但一代测序读长一般只有1kb左右，且通量低进而检测周期长，不能实现快速地检测。尽管二代测序可以提供高通量的测序数据，但是由于该平台读长短，无法准确获取该准种各病毒株的单体型序列，对病毒准种的单体型分析带来了很大的困难。

图1：短读长测序技术难以跨越病毒分子全长，无法准确获取病毒准种的单体型

    PacBio的单分子实时（SMRT）测序技术经过多年的发展，已经使酶读长度增加到平均100 kb。通过优化和平衡酶读长与插入片段的长度，PacBio开发了一种基于CCS（Circular Consensus Sequencing）环形一致性的测序模式，产生HiFi Reads，能够在提供长读长reads的同时兼顾准确性。（参考往期文章：Nature Biotech文章验证了PacBio HiFi Reads进行基因组组装及变异检测的出色性能）PacBio单分子实时测序产生的HiFi Reads可以直接轻松跨越整个病毒基因组，准确分析病毒准种单体型。

图2：PacBio 高准确度长读长测序技术检测病毒全长，准确分析病毒准种单体型

接下来以两篇经典应用文章来给大致介绍下PacBio SMRT 测序技术在病毒研究中的应用。

埃博拉病毒是单链RNA病毒。文章中，给感染埃博拉病毒的猴子注射抗体疫苗，然后定时采集经治疗后的个体血样，取其血清进行分析。开始利用二代测序技术对埃博拉病毒进行测序，发现了一系列单碱基突变，但是由于二代测序读长短，无法获取这些SNP在这些病毒变种分子上的排列，即无法获取单体型信息。作者用PacBio SMRT测序技术解决上述问题。以cDNA为模板，构建了2 Kb的SMRTbell文库，上机测序。通过PacBio SMRT测序技术建立了病毒的单倍体型网络，明确哪些SNP是位于同一个病毒分子上的。结果显示，从感染第14天的样本中检测到9个单体型(包含野生型)，感染后16天的样本中检测到11个单体型，在感染后16天的样本中，野生型病毒只剩17.5%。

下面这篇文章是一位69岁的男性患者，于1991年因HBV相关性肝硬化接受了肝移植，但在移植后6个月被诊断出复发性HBV感染。该患者具有丰富的药物治疗经验，并且随着时间的流逝对LMV，ETV和ADV药物产生了耐药性。在15年的时间里不同阶段收集肝移植后的样本，提取DNA，进行HBV全长基因扩增，构建了3 Kb的SMRTbell文库，上机测序。通过分析HBV基因全长作者研究了患者肝移植15年内HBV病毒的变异过程，绘制了HBV病毒的进化树，在4个时间节点总共检测到95个HBV变异体。 这些HBV的变异体的产生进而导致患者可以躲避宿主免疫反应并在不同阶段对各类药物产生抗药性。

    PacBio SMRT测序技术因高准确度、长读长、单分子均一覆盖等优势已在各个方面得到广泛应用。除上述分享的病毒应用外，PacBio SMRT测序技术在与流行性疾病相关的细菌方面也有诸多的应用案例。PacBio SMRT测序技术除了很好地完成染色体基因组组装外，还能够对所含质粒进行组装，追溯质粒水平转移现象；容易跨越外源基因和宿主基因组整合序列，更准确定位移动元件在基因组上的位置。