该文章由美国西雅图福瑞德·哈金森癌症研究中心Russell等研究人员完成。

     一方面，流感病毒感染细胞在病毒基因表达上差异很大，并且只是偶尔激活先天免疫。另一方面，流感病毒初期很少会触发被感染细胞产生干扰素。这种罕见的IFN诱导表达只是一种极端的细胞间异质性的存在形式，这种细胞异质性在病毒mRNA、蛋白质和子代病毒粒子方面也有很大的差异。

   目前的研究结果还不清楚为什么只有一些受感染的细胞会引发先天免疫反应。两个可能的因素是纯随机性的存在和细胞状态的预先存在的变异。而对于流感病毒来说，第三个可能的因素也很突出:病毒遗传多样性。

    在本研究中，研究人员通过结合使用PacBio长读长测序技术和10X Genomics 单细胞转录组学技术的方法，通过一套独特的富集罕见干扰素阳性（IFN+）细胞的流程，利用10x Genomics Chromium更终获取约1500个人肺部上皮细胞（IFN+和IFN-）分别进行单细胞RNA-Seq检测，使用UMI标记的CCS测序与Illumina 3’端测序reads结合分析，通过确定单个细胞中所有病毒基因的转录组和全长序列，评估病毒种群的遗传变异是如何导致这种异质性的。

图1：表达IFN的流感病毒感染细胞的联合转录组学和病毒测序方法。

现有的技术如流式细胞术和荧光报告只能测量蛋白质水平，而目前的单细胞转录组技术只能测量转录的丰度，只能提供有关其序列的零碎信息。这些技术都不能可靠地揭示感染特定细胞的病毒粒子是否存在某种特异突变。不足以确定病毒遗传多样性如何在感染期间促进细胞间异质性。

而通过联合使用PacBio高准确度长读长测序技术和10X Genomics 单细胞转录组学技术的方法，研究人员获得了超过200,000条高质量的病毒全长序列的CCS数据和单个细胞的完整转录组信息，以此组装出了高质量的单个流感病毒感染细胞中所有病毒基因的完整转录组和全长序列。并通过此结果确定病毒基因型和单细胞感染之间的关系。

图2 ：CCS测序原理

图3：病毒基因型与单细胞感染结果。

为了更加系统地评估与感染结果相关的病毒特征，研究人员又将图3中展示的150个细胞分成两组，一组表达所有8个基因的未突变副本(忽略同义突变)，另一组不表达。结果显示，与用基尼指数(Gini index)量化的其他101个细胞相比，被完全未突变的病毒粒子感染的49个细胞中，每个细胞的病毒mRNA数量的分布明显更紧密。因此，病毒缺陷是造成病毒转录负担异质性的主要因素。

图4：病毒基因型的细胞间感染结果异质性相关的病毒特征

基于病毒缺陷会造成感染细胞中病毒基因表达和IFN诱导表达异质性的结果，研究人员进一步测试了在单个IFN细胞中发现的病毒缺陷是否会导致IFN表达增加，通过使用反向遗传学获得大量带有这些缺陷的病毒。结果显示NS1基因无法表达的病毒诱导IFN更强，PB1内缺失和3个点突变病毒(PB1- d27n、PB1- t677a、NS1-A122V)诱导IFN的频率明显高于野生型。由此可以看出，与IFN诱导更密切相关的病毒缺陷是无法表达NS基因；并且单细胞数据还显示，参与PB1和NS基因编码的蛋白质中的氨基酸取代物在IFN细胞中有富集。

但值得注意的是，即使是更有效的诱导IFN产生的病毒突变体，IFN的产生仍然是随机的。诱导IFN产生的的病毒缺陷作用机制是多种多样的。

虽然本研究的结果中病毒遗传变异不能全部地解释病毒基因表达和先天免疫诱导中细胞间的变异。但总的来说，该研究成果提供了个完整的病毒突变是如何影响单个细胞感染过程的信息描述。

图5：IFN细胞的单细胞病毒测序中发现的一些突变增加了IFN的诱导

      在长读长测序技术和单细胞技术大放异彩的今天，如何将多个尖端技术有效整合来获得更加精确完整的研究成果也逐渐受到了更多科研人员的重视。而面对传统测序技术所带来的的缺陷和不足，越来越多的研究采用了长读长测序技术来进行补充和更加深入的研究。相比与传统的测序技术，PacBio SMRT测序，不仅能够获得长度更长，更为准确的DNA序列信息，用于分析基因组中包括结构变异在内的所有变异。还能借助于高达Q30的准确度，进行单倍型、顺式/反式突变的准确分析。

原文信息：

Russell A B, Elshina E, Kowalsky J R, et al. Single-cell virus sequencing of influenza infections that trigger innate immunity[J]. Journal of virology, 2019: JVI. 00500-19.

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