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qPCR实验中的隐藏绝招：Quencher 淬灭剂
冷 知 识
qPCR实验中的隐藏绝招
Quencher 淬灭剂
在设计您的qPCR实验时，您会经常听到quencher（淬灭剂）这个听起来一股V587的武侠风的词儿。 但您真正了解淬灭剂吗？ 不同淬灭剂之间的区别？ “黑暗淬灭剂”又是什么神一样的存在？ 别急，在揭晓答案之前，让小编先带来四重灵魂拷问： Q1：什么是淬灭剂？ 吃瓜群众 秃头小编 淬灭剂通常指的是具有通过荧光共振能量转移（FRET）机制抑制荧光发射强度能力的一类分子。该方法要求染料（供体）的发射光谱与淬灭染料（受体）的吸收光谱具有足够的光谱重叠。 FRET还要求两个分子处于正确的相对方向和紧密的空间内。 Q2：FRET机制如何运作？ 吃瓜群众 秃头小编 当满足以上条件时，FRET机制将能量从激发的染料转移到淬灭剂，使染料以非辐射方式返回其基态，而两种染料之间没有任何光发射或吸收。同时，通过偶极耦合，受体的吸收能量将淬灭剂提高到激发态。然后，淬灭剂将耗散与供体染料转移成正比例的能量。 Q3：常见的几种淬灭剂，有什么区别？ 吃瓜群众 秃头小编 若淬灭剂是其他某种荧光团，例如TAMRA，则通常会呈现出受体染料发出的光，造成不必要的背景噪音。 若是BHQ染料的淬灭剂，则可称为名副其实的“黑暗淬灭剂”，它们本身没有天然荧光，有助于减低背景信号，提升信噪比。同时，BHQ在可见光谱中具有比其他黑暗淬灭剂如Dabcyl更宽的吸收范围 ，能够抑制多种荧光团产生的信号而又不影响背景荧光，从而能够进行高度多重的核酸测定。 Q4：那究竟BHQ是怎么做到“黑暗淬灭”的呢？ 吃瓜群众 秃头小编 FRET淬灭机制依赖于报告子发射光谱和淬灭剂吸收光谱的空间接近性和重叠性。当非常接近时，通常互相在10纳米的距离内，存在电子相互作用，其中能量从报告染料向淬灭剂的转移导致转移的能量经由淬灭剂消散。如果淬灭剂是诸如BHQ之类的黑暗淬灭剂，则该能量不会引起光子发射，而是当其松弛到基态时会以热量的形式部分释放。 对于BHQ黑暗淬灭剂的好，小编那是三天三夜都说不完，不信？那咱们关门！上图！ 不同类型的BHQ Probes BHQ在可见光谱中具有较宽的吸收范围 不同淬灭的信噪比 (TAMRA vs Dabcyl vs BHQ) 淬灭的两个原理 (Static vs FRET) 在具体了解了淬灭机理后，终极拷问来了，如何有效地选择适合的染料和淬灭剂配对呢？ 选择正确的BHQ染料的重要考虑因素之一是确保选择的吸收剂与荧光报告分子更匹配的淬灭剂。LGC, Biosearch Technologies提供了染料选择表和光谱叠加工具来帮助您做出更佳选择： Spectral Overlay Tool 链接： https://www.biosearchtech.com/qpcr-multiplex-spectral-overlay-tool 更后，小编要为已经浏览到文末的您，额外送上一个Tip，一般人我不告诉ta，嘘—— 除了利用Spectral overlay tool挑选染料和淬灭剂配对，有时还有一些其他基于静态淬灭机理的建议。例如，在选择Quasar®670和Quasar®705染料淬灭剂的时候，即使BHQ-3淬灭剂似乎提供了更佳光谱重叠，但其实它们也能与BHQ-2淬灭剂配合使用。因此，某些染料可能具有多种有效的淬灭剂选择哦~ Biosearch Technologies----荧光引物/探针设计与合成的全球领导者 Biosearch Technologies是专业性荧光定量PCR探针合成及标记服务公司，提供与世界上各种荧光定量PCR仪配套的探针标记方式及荧光素。 创始人Ron Cook及诺贝尔得主Kary Mullis（PCR发明者）共同发明了Biosearch SAM I寡核苷酸合成器，合成了世界上首个PCR引物。 自Real-time PCR于上世纪90年代出现后，Biosearch的科学家们先后研发了被业界视为标准的Black Hole Quencher®（BHQ）黑洞淬灭剂及的CALFluor®和Quasar® 系列染料。 Biosearch拥有丰富的高品质产品线，不仅包括探针和引物产品，广泛应用于药物研发，基因组测序/SNP检测/基因表达分析等领域，也为其他寡核苷酸生产厂商提供核酸合成原材料。包括多种荧光染料和淬灭染料BHQ、具有高表面积电位的CPG支持载体和合成柱、用于寡核苷酸合成和色谱应用的化学活化的多孔玻璃，以及合成及纯化配件等。 基因有限公司为 Biosearch Technologies授权一级代理，想进一步了解更详细的产品信息，敬请留言或直接联系基因有限公司~
