抗体药研发背景

抗体是由效应B细胞分泌的大分子免疫球蛋白，参与协助免疫系统鉴别、中和抗原或其他外来物质。抗体由对称的两条重链及两条轻链组成，其重链恒定区决定抗体亚型，而重链和轻链可变区组合形成抗原结合域。

1975年Kohler和Milstein建立了杂交瘤技术（亦称单克隆抗体技术），该技术将体外可持续培养骨髓瘤细胞与可分泌抗体的B 淋巴细胞融合，经黄嘌呤氨基蝶呤胸苷筛选及克隆化后，得到可分泌特异性抗体的单克隆细胞株，这一技术为治疗性单克隆抗体药物的发展奠定了基础。

1986年个鼠源单克隆抗体药物上市，此后截至2018年底，FDA累计批准上市75个抗体药物。抗体药经过30余年的发展，已成为全球医药市场的重要组成部分，目前大分子生物制药市场（包括重组蛋白类药物）急速增长已突破千万亿美元。

抗体筛选方法学对比及检测

抗体的筛选鉴定中，更经典的方法是ELISA方法。ELISA方法的需要固定抗原，反复洗板去除多余的抗原/抗体，步骤繁琐，检测动态范围低，且不利于微型化，并且对于一些膜蛋白靶点，抗原固定化后会影响其天然构象及表位，阻碍对针对天然表位的有效抗体的发现及研发。随着新的检测技术的出现，有更多的筛选方法进入到抗体筛选流程中，其中免洗高灵敏度Alpha方法极具代表性。

Alpha的全称是Amplified Luminescent Proximity Homogenous Assay，它的作用原理是Donor beads 在680nm处的激发使供体微珠上的光敏剂将周围环境中的O₂转化为更为活跃的单线态氧¹O₂，该反应每秒钟可产生60,000个单体氧分子，单体氧在溶液中可扩散200nm，在此范围内，过程中的能量便会传递到Acceptor beads与其上的化学发光剂发生化学反应，从而激发了一连串的化学发光反应，更后615nm产生信号(AlphaLISA)或是在520-620nm处产生信号(AlphaScreen)。Alpha的独特的优势有非放射性，均相的检测法、灵敏度高、检测窗口（信噪比）大、动态范围广、易于自动化小型化等。

Alpha vs ELISA

 Alpha检测可形象的称为只需混合无需洗涤的ELISA，又因其供体微珠和受体微珠间的信号传递单线态氧分子可达200 nm，比其他的均相检测方法，如TR-FRET（能量传递距离~10nm），更适合生物大分子间的亲和力实验。

Alpha比ELISA方法更适合做阻断型抗体筛选和抑制结合型抗体筛选，因Alpha比ELISA方法具有更高的灵敏度，因此在整个竞争结合体系中所需的样品浓度更低，对于阻断型/抑制结合型的抗体筛选具有更好的分辨率和检测范围。

除了常用的杂交瘤抗体筛选及抗体轻链筛选外，Alpha还可以应用于基于T7或M13噬菌体文库抗体筛选，如确定噬菌体浓度、抗体/蛋白片段筛选等。

 PD-1/PD-L1 免疫检验点阻断剂筛选

对于当前肿瘤免疫治疗中炙手可热的免疫检验点靶点PD-1/PD-L1，在Alpha PD-1/PD-L1结合力检测平台上，明星药物Nivolumab的两个亚型、PD-L1抑制剂Atezolizumab和其他PD-1/PD-L1抑制剂的检测结果也进一步证明，Alpha方法具有极佳的特异性及信噪比，且比传统方法具有更高的检测灵敏度。

为逃脱免疫T细胞追杀，肿瘤细胞会通过特异性表达本应存在于免疫细胞上的PD-L1蛋白，更终逃逸。特别是对基底样乳腺癌（basal-like breast caner），PD-L1的高表达常伴随着肿瘤病情的恶化及不良预后。使用高灵敏度人源PD-L1 AlphaLISA均相免洗试剂盒，可以对肿瘤细胞上PD-L1的表达量进行快速检测及准确定量分析。

CTLA-4的抑制剂lpilimumab是一个获得FDA批准的免疫检验点阻断型抗体药物。对于CTLA4/CD80 阻断剂筛选， 基于Alpha技术的 CTLA4/CD80 结合力检测试剂盒，可以更快、更准确的发现针对 CTLA4和 CD80的阻断剂。对已上市药物CTLA4抗体Iplimumab和 CD80抗体，以及其它非阻断性抗体同时检测，发现Ipilimumab和CD80抗体能特异性阻断CTLA4和CD80的结合，而其他对照抗体对体系无明显影响。

1. Michael E. et al. Bembenek. Determination of complementary antibody pairs using protein A capture with the AlphaScreen assay format. Anal. Biochem. (2011) 408:321–327. [ALPHA/Complementary antibody screening]

2. Peter Cariuk. et al. Evolution of Biologics Screening Technologies. Pharmaceuticals (2013)6:681-688. [ALPHA/Antibody screening]

3. Hiroyuki Takeda. et al. Production of monoclonal antibodies against GPCR using cell-free synthesized GPCR antigen and biotinylated liposome-based interaction assay. Scientific Reports (2015) 5:11333. [ALPHA/Monoclonal antibodies screening]

4. Florio M. et al. A bispecific antibody targeting sclerostin and DKK-1 promotes bone mass accrual and fracture repair. Nat Commun. (2016) 7:11505 [ALPHA/ Bispecific antibody Binding]

5. Desch KC. et al. Probing ADAMTS13 Substrate Specificity using Phage Display. PLoS One. (2015)10(4):e0122931. [ALPHA/Phage display screening]

PerkinElmer公司成立于1937年，总部位于美国马萨诸塞州，致力于改善人类健康和环境健康。针对生物大分子制药研发流程的每一个环节，PerkinElmer公司可提供覆盖分子-细胞-活体-组织的全方位检测技术、仪器平台、试剂耗材及相关服务。

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