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从FFPE样本中获取NGS级别RNA新方法
福尔马林固定石蜡包埋(FFPE)组织在生物医学研究样本中占据很大一部分，从FFPE样本中提取的RNA由于易降解、RNA-蛋白质化学交联以及RNA片段化等原因，严重影响了下游实验数据的质量，尤其是当样本量非常小时，从FFPE组织中提取完整的RNA具有更大挑战，例如，使用激光显微切割(LCM)从FFPE样本中得到的微量细胞群来提取满足下游进行逆转录定量PCR(RT-qPCR)或下一代测序(NGS)分析的需求的RNA 就变得非常困难。
苏黎世大学Parisa Amini，Julia Ettlin等人在BMC Molecular Biology发表题为An optimised protocol for isolation of RNA from small sections of laser-capture microdissected FFPE tissue amenable for next-generation sequencing的文章中，介绍了一种新的、区别于传统方法的样本处理技术，使用新方法从少量脱蜡染色的临床LCM样品中分离RNA，与常规的基于蛋白酶K的提取方法相比，总RNA产量增加了8到12倍，qPCR 结果显示Cq 值平均降低了2.3倍，NGS结果显示下机数据比对率可平均提高1.55%。这种新方法的核心技术就是Covaris 自动聚焦声波技术(AFA)，下面我们一起了解下详细的实验流程和数据结果，以及AFA技术在其中的作用。 作者使用激光显微切割从FFPE样本中分离细胞、并进行RNA提取及下游分析工作流程： 图1 1 选择符合质控标准的病例样本 2 制备FFPE样本切片，进行脱蜡和染色，在显微镜下筛选感兴趣的组织或细胞 3 使用激光显微切割系统切割并获取感兴趣的组织或细胞，并进行组织来源鉴定 4 对获取的组织或细胞进行RNA提取及质控 5 RT-qPCR 6 NGS 由于显微切割获取的样本在制备过程中已经进行了脱蜡染色，因此作者使用传统的FFPE核酸提取方法处理样品时省去了二甲苯和乙醇这一步，直接进行了蛋白酶K消化以及后续的RNA纯化和质控步骤。(图2a)。 作者发现，这样处理LCM样本的结果并不理想，即便是延长蛋白酶K的处理时间，仍然能看到完整的组织，这部分组织中的RNA很难被提取，而LCM样本量少且珍贵，不允许有这样的样本损失。 因此，作者认为蛋白酶K无法对组织样本进行充分消化是造成RNA得率低的主要原因，为了解决这一难题，作者尝试在蛋白酶K处理样本之前增加一个步骤：使用AFA技术对组织样本进行5分钟的匀浆处理(图2b)，正是这一关键步骤，使样本被破碎的更彻底，RNA得率得到显著提高。 图2 为了比较两种方法提取RNA的得率，作者随机挑选了几个样品，使用了RT-qPCR分析了两个管家基因GAPDH和B2M的情况，与单纯使用蛋白酶K相比，使用AFA技术与蛋白酶K相结合的方法提到的RNA的RT-qPCR结果 Mean Cq 低2.3倍，表明这种新方法提取的RNA得率更高（见下表） 更后，作者对两种方法提取的FFPE样本中RNA进行高通量测序实验，对下机数据进行分析，结果如下图所示。文中提到，采用AFA技术结合蛋白酶K提取的RNA比仅用蛋白酶K方法提到的RNA在进行后续NGS实验时，下机数据比对率可平均提高1.55%。 图3 谈一谈Covaris AFA技术 Covaris 采用的聚焦声波技术，通过等温、非接触的方式对样本进行声学匀浆和分解，使不同生物大分子形成的高级复合结构充分解离开来，以获得更完整的核酸片段信息。 AFA技术除了能促进组织裂解之外，还有完整的FFPE样本解决方案，其FFPE样本的脱蜡处理，相比于传统基于二甲苯等有机溶剂的方法，脱蜡更加彻底(图4)，操作也简单(图5)。 图4 图5 除了FFPE样本核酸提取，AFA技术也可为您提供微量样本前处理、DNA 片段化、ChIP等解决方案。详情请看Covaris AFA—高效的FFPE样本核酸提取怎么办？我的ChIP为何屡屡失败？高手！无法想象单细胞蛋白质组学？AFA帮您实现。基因有限公司作为Covaris公司中国区独家代理商，为您提供更完整研究样本处理的解决方案。详细请联系您身边的基因工作人员索要资料，也可以在下方留言哦~ 原文以An optimised protocol for isolation of RNA from small sections of laser-capture microdissected FFPE tissue amenable for next-generation sequencing 为标题发布在 BMC Molecular Biol (2017) 18:22 链接：https://doi.org/10.1186/S12867-017-0099-7
