在自然界中许多高等植物需要通过冬季的低温阶段实现从营养生长到生殖生长时期的转化, 这一生物学过程称作春化作用。FLOWERING LOCUS C(FLC)作为一种重要的开花抑制蛋白负调控春化作用，参与植株从营养生长向生殖生长的转化过程。

      COOLAIR是植物体内天然存在的FLC反义转录本，拟南芥COOLAIR是具有典型的 5’帽子和3’POLY A结构的非编码RNA。根据剪切方式的不同，COOLAIR又分为近端（ClassⅠ）和远端（ClassⅡ）两种类型。其中，COOLAIR ClassⅡ的远端外显子延伸至正向转录本的个外显子和启动子区域，是典型的植物长链非编码RNA（Long non-coding RNA，LncRNA）。

      研究发现，春化作用早期，FLC反义转录本COOLAIR LncRNA的表达量会在低温胁迫下迅速上调；相反，FLC mRNA表达量下调。为了探究COOLAIR LncRNA在拟南芥FLC低温诱导的表观沉默过程中起到怎样的调控作用，英国诺里奇研究所Stefanie Rosa研究团队利用LGC Biosearch公司的单分子荧光原位杂交技术（Stellaris Single-molecule RNA FISH，后面简称Stellaris smFISH）对FLC正义转录本和反义转录本COOLAIR在细胞水平进行了亚细胞时空定位。

       作者发现，在受到低温胁迫时，多数情况下FLC正义转录本和反义转录本不会出现在同一细胞中，即便进入同一细胞，FLC和COOLAIR也会在空间定位上相互排斥（图1）。通过Stellaris smFISH技术，作者发现低温胁迫前4周，FLC成熟mRNA（主要定位在细胞质）荧光点逐渐减少，而前体mRNA（定位在细胞核）荧光点则在低温胁迫2周后消失，因此作者推断FLC mRNA的转录在春化作用早期就会关闭（图2）。同时，COOLAIR的转录则在前2周被激活，多数细胞COOLAIR转录显著上调，且在转录位点附近聚集成云状（图3），通过互斥关系促进FLC正义转录的顺式关闭，再进一步通过改变H3K36me3组蛋白修饰（H3甲基化）动力学影响FLC基因转录（图4）。

        尽管RNA荧光原位杂交在许多模式生物中都取得了不错的效果，但是受样本特殊性以及体内自发荧光的限制，研究植物RNA分子单细胞之间的异质性和亚细胞定位一直以来都是一个瓶颈。Stellaris smFISH是一项能够同时对单个RNA分子进行定位、定量和检测的新型原位杂交技术，除了观察RNA定位情况，还非常适合于分析基因转录位点活性、RNA-蛋白互作，以及RNA的转位和迁移，除了应用在人、小鼠、果蝇、斑马鱼、酵母、线虫、病毒等常规模式生物上，Stefanie Rosa的研究证明该技术对植物模式生物拟南芥也同样适用，同时她相信，只要对前期样本处理进行一定优化，应用于其它植物也不是问题，而植物绿色组织自发荧光的问题可以借鉴其它物种上的成功经验，通过Tissue Clearing和冷冻切片进行克服。Stefanie声称，这项成果无疑为植物基因调控研究增加了新的强有力工具！

        随着近年来转录组研究迅猛，以及高水平杂志对数据准确性的要求越来越高，要确定前期筛选靶标的表达量、分子功能及作用机制，必须经过原位的验证。对靶基因进行组织学水平或者细胞学水平的单分子RNA 原位杂交可以实现对研究对象的精准原位定量。除了是传统蛋白水平IHC/IF和DNA 水平DNA FISH原位验证的有力补充，Stellaris RNA FISH由于不受抗体的限制，在植物及微生物研究领域也有着独特的优势，且对于时下热门的lncRNA、cirRNA等不表达蛋白的非编码RNA，也是绝佳的选择。Stellaris smFISH技术自发明以来，以操作简单、灵敏度高、特异性好且适用性广而著称，同时非常适合于多重RNA共定位，以及RNA-蛋白共定位。这项研究的共同作者Susan Duncan表示，她非常喜欢这项技术，因为她可以确切了解RNA的位置。“这非常直接。”她说，“实际上，这就是眼见为实。”

更多应用：

利用Stellaris mFISH原位杂交揭示多分体病毒侵染机制

参考文献：

【1】Rosa S, et al. Mutually exclusive sense–antisense transcriptionat FLC facilitates environmentally induced generepression. Nature Communications. 2016.

【2】Duncan S, et al. A method for detecting single mRNA molecules in Arabidopsis thaliana. Plant Methods. 2016.

【3】Csorba, T, et al. Antisense COOLAIR mediates the coordinated switching of chromatin states at FLC during vernalization. PNAS. 2014, 111, 16160–16165.

【4】张绍峰等. 植物非编码RNA调控春化作用的表观遗传. 遗传. 2012, 34(7): 829-834.

Stellaris smFISH是LGC Biosearch公司明星产品，基因有限公司作为LGC Biosearch授权一级代理， 自1992年成立以来，致力于为科研人员引进国内外先进技术，欲进一步了解Stellaris smFISH技术及更详细的产品信息，敬请留言或直接联系基因有限公司。