来自加州大学欧文分校和加州理工大学的科学家更近研发出一套评估长读长测序平台转录组测序性能的分析流程TALON。该研究小组使用TALON分析流程比较了PacBio Iso-Seq和Oxford Nanopore（ONT）的直接RNA转录组测序。

TALON分析流程

研究小组首先使用PacBio和ONT平台分析了三种不同的人ENCODE Tier 1细胞系（GM12878、K562和HepG2）的转录组，以量化评估两种长读长平台的性能。首次系统比较了：1）PacBio Iso-Seq和ONT直测RNA转录组的定量能力。2）两种技术方法发现已知转录本（FSM），非全长转录本（ISM）、包含已知剪切元件的新转录本（NIC）和包含未知剪切元件的新转录本（NNC）的能力。3）PacBio Iso-Seq结果与Illumina平台RNA-seq结果的一致性。

不同转录本分类示意图

通过对3种已经充分研究的细胞系转录组进行生物学重复检测，在基因表达水平以及可变剪切水平来考察PacBio和ONT的数据重复性。可以看出无论是在基因表达水平还是可变剪切水平，PacBio Iso-Seq都有着极佳的重复性，Pearson值分别可以达到0.96和0.86。而ONT平台的重复性则较差，Pearson值只有0.68和0.38。

PacBio Iso-Seq与ONT直测RNA转录组数据重复性比较

研究小组使用人类标准转录组数据库ENCODE对分别对比了使用PacBio与ONT平台在GM12878、K562和HepG2细胞系中检测出的各种转录本的数量。与ONT的直接RNA转录组相比，PacBio Iso-Seq有着更多的已知转录本检出量（Known:～20000 vs ～8000）和更少的非全长转录本检出量（ISM:～5000 vs ～6000）。而对于新转录本的发现(NIC and NNC)，PacBio Iso-Seq也有更好的表现。

PacBio与ONT检测出的各种转录本的数量，Known是在人类参考转录组数据库中已有的转录本；ISM是非全长转录本；NIC是包含已知剪切元件的新转录本；NNC是包含未知剪切元件的新转录本，请注意两张图的Y轴值并不相同。

研究小组对PacBio Iso-Seq和Illumina RNA-seq进行了差异表达分析。使用EdgeR中的精确测试方法计算PacBio和Illumina之间的对数倍数变化，并对得到的p值进行多重测试的Bonferroni校正。该分析显示PacBio平台和Illumina平台检测出的大多数基因的表达水平没有显著差异，一致性高，如下图所示。

PacBio Iso-Seq与Illumina RNA-seq数据相关性

更后，研究人员在通过小鼠皮质和海马的PacBio转录组的比较证实TALON对来自同源细胞系的PacBio数据的可重复性和稳健性之后，决定应用该分析流程来研究小鼠皮层和海马的复杂组织中的可变剪切亚型。发现即使在经过充分研究的组织（如皮质和海马组织）使用PacBio Iso-Seq也能够检测到丰富的新的可变剪切亚型。

PacBio Iso-Seq检测到的Mef2a isoform在皮质和海马中表达

总结：

研究人员证明了当具有足够的测序深度（> 100万reads时），长读长测序能够可重复地量化同源细胞系和复杂组织中的基因和转录物表达。通过研发跨测序平台的长读长测序转录组分析了流程TALON，它简化了跨不同数据集比较长读取转录组的过程，并允许直接比较PacBio和ONT转录组。从结果来看PacBio与Illumina数据的相关性很好，PacBio Iso-Seq有着比ONT直测RNA转录组更好的全长转录本检测能力以及更好的重复性。即使在经过充分研究的组织（如皮质和海马组织）应用PacBio Iso-Seq也能够检测到丰富的新的可变剪切亚型。单细胞RNA-seq领域目前在使用短读长测序技术的基础上蓬勃发展，如果使用长读长测序则能够在不同的维度（isoform水平）来研究单细胞转录组。使用长读长测序进行全长转录本分析，更终将使我们能够准确地表征和量化细胞中的实际功能形式的mRNA。

参考文献：

Wyman, Dana, et al. "A technology-agnostic long-read analysis pipeline for transcriptome discovery and quantification." BioRxiv (2019): 672931.

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