ELISA是目前使用广泛的基于抗体-抗原特异性识别的生物标记物检测方法。在常规的 ELISA实验中，或许你会对这些问题并不陌生：

Ÿ   检测灵敏度不够：无法检测低丰度痕量样品；

Ÿ   动态检测范围过窄：须多次稀释样品，防止过饱和；

Ÿ   显色底物稳定差：需严格控制显色/终止/检测时间，保证批次间数据重复性。

说到这里，忍不住给洗板洗出强大臂肌的实验同仁们安利一下PerkinElmer的均相免洗检测技术： LANCE Ultra. 这个技术分为两部分：

时间分辨荧光检测

时间分辨荧光检测（Time-Resolve Fluorescence Resonance Energy Transfer, TR-FRET）利用物质荧光寿命的差异来选择和检测具有长荧光寿命的目标分子。在一般的荧光检测中，样品受到激发光照射时，其中的杂质和样品容器材料也会受到激发而发出荧光，这些自体荧光和激发光的散射光等会与目标荧光一起被检测到。然而，这类荧光的寿命为10纳秒左右，很快就会衰减。使用荧光寿命较长的铕螯合物，等到背景荧光已完全衰减后再检测荧光（时间分辨荧光检测），就能够以较高的灵敏度单一地检测铕螯合物的荧光 （图1）。

图1：时间分辨荧光检测的原理。使用具备时间分辨检测功能的多级计数器将340nm的激发光按每秒1,000次脉冲的频率进行照射。每一次脉冲期间，等待400微秒后，测量400至800微秒期间的荧光。

LANCE Ultra

PerkinElmer 首先推出基于铕（Eu）标记的时间分辨荧光共振能量转移检测（TR-FRET检测）产品。在合成 Eu 螯合物、开发以及优化基于螯合物的检测系统方面，已有 30 多年的经验。

原理

图2： LANCE Ultra原理图。铕 (Eu) 螯合物标记的抗分析物抗体和 ULight 标记的抗体。激发光照射 (320/340 nm) 后，Eu 螯合物受到激发，并将能量转移 (FRET) 至附近的受体荧光物质 ULight , 使其受到激发并发射 665 nm 的光信号，再通过带有时间分辨荧光（TR-FRET）检测模式的酶标仪进行检测。

实验步骤：

图3：LANCE Ultra实验步骤图。仅需将样品与试剂加入孔板中，操作简单。无需洗涤和分离，只需混合操作的检测方法。

LANCE Ultra技术优势:

Ÿ   无需洗涤

仅需将样品与试剂加入孔板中，操作简单。无需洗涤和分离，只需混合操作的检测方法

Ÿ   高通量

检测步骤少，易于操作，通量高。使用自动分液设备可实现从加入试药到测定步骤的全自动操作，非常适合筛查和评估大量样品。

Ÿ   抗生物素干扰（可使用 RPMI 培养基）

由于本检测方法不使用生物素标记的试剂，因此检测 RPMI 培养基等含有较多生物素的样品时不会受到生物素的干扰。

Ÿ   可使用配备TR-FRET 检测功能的微孔板检测仪

可使用配备时间分辨荧光检测功能的微孔板检测仪。

对比试验

那么基于TR-FRET的LANCE Ultra和类似技术HTRF^® (Homogeneous Time-Resolved Fluorescence)相比，表现如何呢？

图4：IL-6, IL-8, and TNFα的标准曲线。在检测IL-6 (LDL=10-15 pg/ml)和TNFα (LDL=20pg/ml)时，LANCE Ultra和HTRF^®具有相同的灵敏度。而在检测IL-8时LANCE Ultra (LDL=5 pg/ml)的灵敏度要远高于HTRF^® (LDL=20 pg/ml)平台。

在RPMI培养基中定量检测细胞因子IL-1β, IL-6和TNFα：

在RPMI培养基中梯度稀释3种细胞因子IL-1β, IL-6和TNFα，利用LANCE Ultra TR-FRET生物标记物检测试剂盒作出标准曲线：

图5：RPMI培养基中对于IL1β, IL-6和TNFα的LDL (Lower Detection Limit, 检测极限)分别为19 pg/ml, 93 pg/ml, 30 pg/ml.

目前可检测的因子涵盖血管生成、自体吞噬、生物药物相关、癌症、心血管、中枢神经、炎症、代谢、激素，新的试剂盒也在不停研发中。而在下一期，我们将会介绍更强大的生物标记物检测技术AlphaLISA，对于成分复杂的样品（包括细胞培养上清，血清等）中，无论是稳定性，检测窗口与可重复性都有卓越表现。Stay tuned!

可能传统ELISA使用者都曾遇到这个问题：对于一些复杂样品或有色样品， ELISA 光吸收读值会容易受到干扰。前面介绍了基于时间分辨荧光的LANCE Ultra检测技术，而下面将会放出PerkinElmer强大的检测神器：AlphaLISA.

AlphaLISA检测生物标记物

1. 原理

图1：AlphaLISA检测原理图。该技术使用供体和受体两种微珠，识别不同位点的特异性抗体分别被直接或间接地偶联到供体微珠或受体微珠上。当有分析物存在时，供体微珠和受体微珠通过抗体识别分析物被拉拢靠近。在680nm激光激发下，供体微珠表面的光敏剂受到激发，将周围的氧转变为激发态的单线态氧。单线态氧向供体微珠周围扩散，到达附近的受体微珠后可在微珠内引发化学发光反应，并更终发射出光，就可以检测到AlphaLISA发光信号。如果分析物不存在，两种珠子不会被拉近，供体微珠产生的单线态氧不会到达受体微珠，从而不会引发化学发光反应。

优势：

Ÿ   均相实验：无分离及水洗步骤，极大的缩短了操作和实验时间

Ÿ   高检测灵敏度：Alpha技术中，与单线态氧发生反应的受体微珠的发光时间较长（半衰期：300毫秒），因此可在激发光照射完一段时间后（20毫秒后）再开始检测，从而有效避免自发荧光的影响。此外，检测波长比激发波长更短，而自发荧光的波长比激发波长更长，因此自发荧光的影响也会进一步降低。

Ÿ   方便自动化：适合高通量及超高通量检测

Ÿ   极宽的线性范围：3-4个数量级

2. 实验步骤

图2： AlphaLISA检测生物标记物实验步骤：只需简单混合即可检测，不需分离和洗涤。

3. AlphaLISA vs ELISA

跟ELISA相比，AlphaLISA具有检测窗口大，信号稳定，实验操作时间短的优势（图3）。大部分ELISA都能轻松转换成AlphaLISA。

图3. A) AlphaLISA与ELISA主要性质对比。B) AlphaLISA与ELISA实验步骤对比

应用实例：TNF-α检测

TNF-α是一种重要的多功能促炎因子，与多种疾病的研究有关。一般来说，TNF-α的检测都有着非常高的灵敏度以及宽泛的动态检测范围要求，尤其在复杂样本（如细胞培养基上清，细胞理解液，含血清样本）中，信号抗干扰性要求更高。

1. AlphaLISA vs ELISA

图4：ELISA和AlphaLISA检测的TNF-α 曲线（96孔板）

传统ELISA实验对TNF-α的检测具有良好的一致性与灵敏性，更低检测下限为16pg/ml，检测上限为2,000pg/ml, 线性和动态检测范围分为1和2个数量级，符合该方法的普遍灵敏度。而AlphaLISA实验对TNF-α的检测具有更宽的浓度检测范围和更好的灵敏性。其更低检测下限仅为2.2 pg/ml，检测上限为50,000pg/ml， 线性和动态检测范围分为2.5和4个数量级。

2. 同一孔中直接检测TNF-α

AlphaLISA检测信号具有良好稳定性，因此可以直接在含细胞的培养基中进行检测。例如在含有THP-1细胞的RPMI培养基中检测诱导释放的TNF-α：

图5：A) 标准曲线：用含有THP-1细胞或不含有THP-1细胞的培养基制作标准曲线.  B) 呈对数生长状态的THP-1细胞中加入LPS诱导4小时后直接在同一个孔里面加入AlphaLISA检测释放的TNF-α。

• THP-1细胞在LPS诱导下释放的TNF-α能在同一个孔中直接检测出，无需额外转移步骤

• AlphaLISA检测灵敏度没有受体系中的细胞所影响

• 即使RPMI中还有游离生物素，AlphaLISA仍展现出良好灵敏度

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Reference:

1. Head-to-Head Comparison of LANCE Ultra and HTRF Assays for Measuring the Presence of Pro-inflammatory Cytokines, Technical notes. http://www.perkinelmer.com/lab-solutions/resources/docs/TCH_LANCE_Biomarker_HTRF_Comparison.pdf

2. High Throughput Quantitation  of Cytokine Biomarkers using LANCE Ultra TR-FRET Assays, APPLICATION NOTE, http://www.perkinelmer.com/lab-solutions/resources/docs/APP_LANCE_Ultra_inflammation_biomarkers.pdf