Western Blot 是分子生物学中研究蛋白的经典方法，被广泛应用于检测细胞或组织样本中蛋白的表达量或者修饰情况。随着文献发表的要求越来越高，传统的定性或者半定量已经无法满足研究者对于Western blot高质量的数据要求，研究者更多的是追求高度实验重复性和定量的准确性。那么对于定量的准确性而言，均一化的选择就显得尤为重要。Western Blot实验中的均一化分析，用以校正不同样本之间、不同泳道之间的差异，获得准确、可重复的Western Blot数据。通常我们会以内参蛋白作为均一化的标准。

Question 1：内参蛋白真的可以作为均一化的标准吗？

         更常用也是更经典的方法是用看家蛋白做内参进行均一化，看家蛋白又称管家蛋白，一般被认为在所有的组织中表达恒定且不受实验条件的影响，主要包括 Actin/Tubulin/GAPDH等，但是近年来越来越多的研究表明，在某些实验条件下，看家基因的表达会因不同类型的组织来源、不同的发育阶段、或不同的实验条件而变化。另外，用看家蛋白进行均一化需要注意信号饱和的问题，因为一般情况下看家基因表达丰度相对于目标蛋白丰度较高，两种蛋白可能存在不同的线性范围，为此实验人员往往需要调整上样量。因此在WesternBlot实验中，用来进行均一化的内参是否合适，是否可以作为精确定量的均一化标准？是需要研究者首先在心中打个问号的。

解决方案：加入外源指示剂来判读内参蛋白是否可以作为均一化的标准。

        那么如何确定选择的内参是否合适？——LI-COR 提供的 Odyssey^® Loading Indicators (OLI) 可以帮助您解决这个问题。Odyssey^®Loading Indicators 是一个标记了 IRDYE 700/800近红外荧光染料的28KDa 的外源重组蛋白质，在电泳上样前与样品按照一定的比例混合上样，随在western blot 结束之后可以实现在Odyssey 近红外激光成像系统上进行观察。通过外源加入的 Indicators 的荧光值可以判断不同泳道之间：a.上样的一致性； b.转膜效率的一致性；c.内参蛋白的表达是否可以作为均一化的标准。

       我们通过两个实例来揭示 Odyssey^® Loading  Indicators  是如何实现对内参蛋白是否可以作为均一化的标准进行判读的。 Figure 1.显示实验中选取的COX IV的内参在不同泳道上的表达与外源加入的OLI 是几乎一致的，在此实验中， COX IV可以作为均一化的标准，可以实现对目的蛋白pERK进行精确的定量。而 Figure 2. 中，经过Etoposide的刺激后，两种内参蛋白Tubulin和COX IV  的表达都受到了影响，而不能作为该实验的均一化的标准。

Question 2：除了内参蛋白之外，还有其他均一化方法吗？

        那么，针对内参蛋白不能作为均一化标准的情况下，该如何进行均一化呢？ LI-COR也给出了更合理的解决方案——总蛋白染色 REVERT™ Total Protein Stain。LI-COR  REVERT™ Total Protein Stain是对膜上总蛋白进行染色，更终在Odyssey近红外激光成像系统的 700nm 通道上检测，成像背景较低，灵敏度较高，因此能够校正Western Blot的所有步骤。

解决方案： REVERT™ Total Protein Stain 与内参蛋白或其他总蛋白染色相比更加合理。

     REVERT™ Total Protein Stain   VS   内参蛋白

1. REVERT™ Total Protein Stain可以适用于任何的生物条件下，消除了不同生物条件下内参蛋白表达不恒定的影响；  

2. 消除了内参蛋白Stripping或者跑两块胶带来的变异差异； 

3. 内参蛋白一抗的批间差异也会造成实验结果的重复性问题，而总蛋白染色则避免这一问题。

      REVERT™ Total Protein Stain   VS  其他总蛋白染色

与其他总蛋白染色方法相比， REVERT™ Total Protein Stain 也具有很明显的优势:

1. 例如普通的考马斯亮蓝染色，是不可逆染色，往往需要同时跑两块胶，一块胶进行染色另一块胶进行后续免疫试验，存在不能校正转印差异的问题，而REVERT™ Total Protein Stain 则是在 PVDF /NC膜上进行可逆染色；  

2. 虽然丽春红染色是可在膜上进行总蛋白染色，但丽春红染色的灵敏度和线性范围与REVERT™ Total Protein Stain 则相差很远，不能作为精确定量的均一化选择；   

3. Stain Free技术是对胶上或膜上总蛋白进行染色，但由于其与蛋白是共价不可逆结合，因此可能会影响抗体与靶蛋白的结合，并且在膜上的背景较高、线性范围也比较窄，且需要特制的预制胶，增加了实验成本，而REVERT™ Total Protein Stain 则是可逆反应，不影响后续抗体结合，非常容易实现在Odyssey系统上的双指标同时定量，不需要改变原有的实验条件和实验体系，是一种既经济又准确的均一化方法。

       综上，不论选择哪一种均一化方法，目的都是为了得到准确的可重复的实验数据。而不同的均一化方法也各有各的特点，了解每种均一化方法的特点，选择符合您实验目的、生物学条件的均一化方法，以校正不同样本之间的差异，才有可能得到高质量数据。 LI-COR 提供的两种解决方案Odyssey^®Loading Indicators（可以帮助您对内参蛋白的均一化标准进行判读）或者 REVERT™Total Protein Stain（总蛋白染色均一化）都可以帮助您在Odyssey 近红外激光成像系统上实现目标蛋白的准确定量。

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