对于CAR-T开发者来说，除了选择合适的肿瘤抗原很重要以外，如何增强CAR-T细胞的增殖活性和杀伤活性也是多年来的一个研究重点。这期就来总结一下提高CAR-T活性的研究都有哪些。

CAR-T 的发展历史主要是围绕增强活性为主。CAR-T 1.0到CAR-T 3.0的变化主要体现在了CAR的胞内信号区。CAR-T 1.0只用CD3ζ信号链上的酪氨酸序列作为“信号1”来激活T细胞。而CAR-T 3.0则是在信号1的基础上加上了两个共刺激信号CD28和CD137，这不仅使其分裂活性获得提升，还促进了IL-2的合成与表达和抗凋亡蛋白Bcl-xL的分泌，从而抵消肿瘤细胞微环境带来的不利影响，但不影响其抗原特异性。

图1：CAR结构发展过程

Nature Reviews上面的一篇综述就总结了一些能提高CAR-T效果的方法。

图2 [1]：改善CAR-T治疗效果的方法总结。 a. 武装CAR-T细胞：T细胞不仅表达CAR，还会分泌IL-2来抵抗肿瘤微环境的抑制。b. 双受体CAR: 双受体CAR-T包含了识别肿瘤细胞抗原的CAR和把肿瘤细胞分泌的细胞因子转化成活化信号的CAR. c. 自然杀伤细胞（Natural killer cells, NK细胞）受体CAR: 把NK细胞的受体，如NKG2-D，整合到抗原识别域，可增强CAR-T细胞对正常细胞和肿瘤细胞的分辨能力。d. 阻断免疫检查点：来自于肿瘤微环境的免疫检查点信号PD-1或者CTLA‑4会对T细胞活性造成抑制作用。通过利用这两者的受体抗体就可以阻断其配体-受体的结合，削弱对T细胞的抑制。 e. 改善T细胞持久性：由于机体会对CAR衍生的外源多肽产生免疫反应，更终导致改造的免疫细胞的破坏。通过向胰腺癌病人回输两种不同靶向的CAR T细胞（一种识别CD19，一种识别mesothelin），其中CD19-CAR用来清除B细胞，从而阻止破坏mesothelin-CAR抗体的产生，更终改善CAR T细胞持久性。f. 靶向肿瘤血管细胞：血管生成素，如VEGF，会导致肿瘤的恶化与迁移。一些肿瘤基质细胞或者肿瘤细胞会大量表达VEGFR-2。一些临床前的研究表明，靶向VEGFR-2的CAR T可有效去除肿瘤基质细胞，但不会对正常细胞有影响。

可以看出，如何提高CAR-T增殖活性和杀伤力将继续是研究工作者们的一个重要主题。那通常评价CAR-T细胞的活性和杀伤力的方法都有哪些呢？

免疫细胞 (Effector) 对肿瘤细胞 (Target) 杀伤活性评价

免疫细胞肿瘤杀伤活性的体外评价过程都涉及到免疫细胞 (Effector) 和肿瘤细胞 (Target) 两种细胞存在，因此不能采取传统的细胞增殖活性检测手段 (如 MTT、ATP 等方法) 直接进行检测。需要采用其他标记手段。

1. EuTDA 时间分辨荧光检测

EuTDA Cytotoxicity的检测原理与同位素 51Cr 释放的方法相似，通过特异性乙酰酯化的荧光探针BATDA标记 Target 肿瘤细胞，酯化的BATDA可穿透细胞膜随后被活细胞内的乙酰酯酶去乙酰化，去乙酰化的TDA 不能再次透过细胞膜而滞留的细胞内。然后洗涤离心去除多余染料，加入 Effector  免疫细胞，裂解后的 Target 肿瘤细胞将 TDA 释放到上清中，与时间分辨荧光探针 Eu 结合形成 Eu-TDA 复合物，更终通过检测该复合物的时间分辨荧光信号评价免疫细胞杀伤活性。

图3：BATDA 检测原理图

该方法具有更高的检测灵敏度，操作性、安全性及数据稳定性等方面也更有优势。EuTDA Cytotoxicity检测方法已被广泛应用于细胞杀伤活性评价，目前已有近千篇学术论文采用该检测方法。

评价CAR T细胞增殖活性

1. 免疫细胞代谢活性 (ATP 含量) 化学发光检测

ATP（三磷酸腺苷）是细胞活性的标志物，其仅存在于具有代谢活性的细胞内。由于萤光素酶和其底物 D-luciferin 反应需要ATP的存在才能产生光信号，其产生的化学发光信号同 ATP 含量成正比，因此可以通过检测发光强度反映细胞的代谢活性。PerkinElmer的ATPLite试剂盒是基于这个反应来达到高灵敏地检测细胞活性（更低 5 个细胞/孔），线性范围可达 5 个数量级，操作步骤简单，且信号稳定。无论是从灵敏度还是实验操作，都优于传统的MTT/XTT方法。

图4：生物发光反应

图5：ATPlite 1 step实验操作流程

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参考文献：

 [1] Jackson, Hollie J., Sarwish Rafiq, and Renier J. Brentjens. "Driving CAR T-cells forward." Nature reviews Clinical oncology 13.6 (2016): 370.