Figure 2B：延时观测 LC3 蛋白在 LepB 干预下的核内聚集时序变化

目的：利用活细胞延时成像排除免疫染色伪影，并观测莱普霉素 B( LepB )干预下 GFP-LC3 在细胞核内聚集的时序变化规律。

方法：细胞与转染准备选用人眼小梁网 hTM 细胞，分两组腺病毒转染：对照组：转染空载体腺病毒 AdGFP（仅表达游离绿色荧光蛋白 GFP）实验组：转染融合蛋白腺病毒 AdGFP-LC3（表达带 GFP 荧光标签的 LC3 自噬蛋白）。两组细胞转染完成后，统一施加 LepB 孵育处理，LepB 作用靶点为 XPO1/CRM1 核输出通路，用来阻断蛋白从细胞核向细胞质转运。依托 CELENA® S 活细胞成像系统搭载的恒温活细胞培养环境与多通道荧光模块，对两组细胞进行长时序连续追踪成像，持续24小时捕捉 GFP 荧光信号变化。

结果：施加 LepB 抑制核输出通路后，GFP 标记的 LC3 蛋白随时间推移不断在细胞核内堆积，核内荧光斑点逐步变大、信号持续增强；仅 GFP 空载对照组细胞核内无荧光聚集，证明信号来自 LC3 蛋白本身。

Figure 2C：WGA 共处理验证 LepB 诱导 LC3 核聚集不依赖经典主动核输入通路

目的：探究肌钙蛋白 （Wheatgermagglutinin，WGA），阻断经典主动核输入通路是否会抑制 LepB 引发的 LC3 核内斑点生成，判断 LC3 进入细胞核是否依赖 WGA 敏感型主动转运途径。

方法：对转染 AdGFP-LC3 的 hTM 细胞，同时加入 LepB 与 WGA共同孵育处理，使用活细胞荧光成像观测核内 GFP-LC3 斑点生成情况。

结果：即便存在 WGA 阻断核输入，细胞内依旧能形成明显的 GFP-LC3 核内荧光斑点；WGA 无法抵消 LepB 带来的 LC3 核蓄积效应。LepB 诱导产生的核内 LC3 斑点，不依靠 WGA 所抑制的经典主动核输入通路，LC3 进入细胞核存在其他转运方式（如被动扩散）。

Figure 2D：洗脱 LepB 验证 LC3 核蓄积效应具有可逆性

目的：验证 LepB 造成的 LC3 核蓄积效应是否具备可逆性，反向证明 XPO1 核输出通路是调控 LC3 核质分布的核心开关。

方法：① 先用 LepB 处理 AdGFP-LC3 转染的 hTM 细胞，充分诱导细胞核内大量 GFP-LC3 荧光斑点形成；

② 处理 72 小时后，彻底更换新鲜培养液洗脱移除 LepB 抑制剂；

③ 采用CELENA S延时成像持续追踪核内 LC3 斑点的动态变化，全程影像同步录制为 Video S2、S3。

结果：撤去 LepB 后的 7–12 小时：细胞核里的 LC3 斑点开始逐步解体消散；洗脱 24 小时后：核内荧光斑点完全消失；动态视频可见：核内 LC3 蛋白向外转运至细胞质，和胞质里原有 LC3 聚点融合，最终均匀弥散分布在细胞质中。

Figure 6A：SIRT1 抑制剂干预下 hTM 细胞 LC3 核定位荧光成像

目的：既往研究表明饥饿环境下核仁富集的 SIRT1 可通过对 LC3 去乙酰化，促进核内 LC3 转运至细胞质并启动自噬，本实验旨在探究在 hTM 细胞周期性机械拉伸（CMS）应激体系中，SIRT1 是否同样依靠调控 LC3 核质分布来介导机械应力诱导的自噬，同时验证阻断 SIRT1 活性是否会造成 LC3 在细胞核内蓄积。

方法：一方面先复刻文献中的饥饿对照实验验证细胞体系可靠性，另一方面使用 SIRT1 特异性抑制剂 EX527 处理细胞以抑制 SIRT1 功能；细胞表达 tfLC3 荧光标记蛋白。借助 CELENA® S 分别录制饥饿组动态 Video S4、EX527 处理组动态 Video S5。

结果：饥饿处理可成功驱动 tfLC3 的 GFP 荧光信号从细胞核转移至细胞质，和已发表文献结论一致，证明本次实验体系稳定可信；而经 EX527 抑制 SIRT1 活性后，Figure 6A 成像与 Video S5 动态画面均显示细胞没有出现 LC3 核内堆积的情况， Figure 6B WB结果也证实 EX527 无法削弱机械拉伸引发的自噬，说明 CMS 诱导 hTM 细胞自噬的调控通路并不依赖 SIRT1 介导的 LC3 核质转运机制。