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告别酶法局限：Covaris AFA技术提升生殖系测序的稳定性与准确性（上篇）
生殖系测序（Germline Sequencing）通常基于全基因组测序或外显子测序分析遗传性基因变异，评估个体对特定疾病（尤其是罕见病和癌症）的易感性。而且生殖系测序有别于一般研究，对于测序流程的稳定性要求更高，需要优化现有工作流程以提高精准度、工作效率，解决诸如DNA片段化不一致、文库转化率欠佳、针对样本输入量变化的繁琐优化及其导致的测序偏差等关键挑战，确保高质量数据产出和准确的变异调用。 Covaris基于非接触式自动聚焦超声（AFA®）技术推出了truCOVER WGS PCR-free Library Prep Kit (PN 520361，以下简称truCOVER)，提供了一种简单易用的解决方案，是生殖系样本制备的理想选择。本篇通过实测数据证明了AFA+truCOVER试剂盒能在不同测序仪上实现无偏的插入片段大小分布、降低数据重复率以及增强变异调用精度。 Covaris AFA技术如何提升生殖系测序的稳定性与准确性 样本批次均一性更好，在不同测序仪上实现无偏的插入片段大小分布 基于酶法的片段化易受GC和AT富集区域、试剂盒的批次间差异的影响，生成结果的重复性不足，导致耗时且增加成本。相比之下，基于Covaris AFA剪切技术和truCOVER的文库制备工作流程提供了可重复且无偏的测序性能：减少了测序变异性，提高了数据质量，并确保了高效的文库性能，即使对于降解的FFPE组织等具有挑战性的样本也是如此。 图1. 解决片段化偏差、大小均一性的一致性问题。（A）对两个不同批次的酶法片段化试剂盒的比较证实了批次间差异。（B）基于酶法表现出明显的片段化偏差，尤其是在片段化位置偏好方面。（C）使用从四种不同样本类型（对照（黑色）、血液（蓝色）、FFPE（红色）、唾液（橙色））中分离的基因组DNA进行文库制备后的片段大小分布叠加。基于AFA超声剪切技术和truCOVER试剂盒显示出一致且均匀的片段图谱。 降低重复率，提升数据质量 片段化的精确控制也能很大程度避免簇生成对片段大小的偏好，影响测序数据的覆盖度。与酶切片段化的DNA相比，AFA技术凭借更低的重复率，可生成复杂度更高的文库，且在相同测序深度下能实现更高的覆盖度。 图2. 与采用酶切片段化的工作流程相比，AFA+truCOVER文库制备方法的重复率更低、文库复杂度更高。 增强变异调用精度 在不同样本和技术重复中实现一致的变异检测，对于临床应用中基因组分析至关重要。为了评估这一点，从同一供体获得血液和唾液DNA，使用不同DNA片段化方法（包括酶法和超声剪切）和不同的样本制备方法（truCOVER文库制备方法、转座和基于酶法片段化的文库制备）进行测序分析。在生殖系变异调用中，truCOVER在不同样本类型间均表现出优异性能，SNP和Indel检测的一致性高达90%（图3）。 图 3. 基于GATK 流程（A）和DRAGEN流程（B）对血液和唾液样本变异调用的一致性和准确率的分析（3个重复）。 建议使用毛细管电泳系统（如Agilent片段分析仪）评估文库片段大小分布。 建议使用荧光法（如Qubit荧光计或PicoGreen™测定）确定文库中双链DNA的浓度。 如果遇到FFPE样本，由于其DNA常经过化学修饰，会极大地影响扩增效率，因此在Pooling之前，建议使用KAPA® Library Quantification Kit (Roche ® PN KK4824)对从FFPE样本制备的文库进行定量，该试剂盒使用与P5和P7 Illumina接头序列互补的引物，能够精确定量可测序（即可扩增）的分子。 即对高质量的样本可以选择基于质量的（基于荧光法）定量，对降解的或具有挑战性的DNA样本选择基于qPCR的（基于可扩增性的）定量，均可实现样本Pooling准确性。并且基于质量的定量方式，不仅能节省耗材，还能省时省力。 联系我们 想了解更多关于Covaris如何助力您的生殖系测序工作流程？请识别下方二维码与产品经理进一步交流或者联系您身边的基因人！ 关于基因 基因有限公司成立于1992年，是一家提供生命科学科研仪器、试剂耗材和技术服务的综合服务商。基于“Gene Brightens Every Life • BioTech Connects the World”——“基因燃亮生命 • 生物技术连接世界”的愿景，专注于生命科学领域前沿技术的引进和推广，致力于推动该领域国内科研机构硬件水平及实验方案的革新与升级。同时，公司也一直致力于自主品牌的科研设备的研发与生产，拥有一系列通用性强、互补性高的自主品牌产品。 基因的服务网络遍及全国各地十多个大中城市，拥有包括仪器销售，试剂销售，市场与技术支持，维修，客服，物流等多个部门组成的完整服务体系。 我们希望通过不懈努力，为您的成功铺路搭桥，也为中国的生命科学事业赶超世界先进水平尽一己之力。欲了解更多信息，请访问www.genecompany.cn。
