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In-Cell Western：你还在跑胶吗？
W B 在当今生命科学研究领域中，蛋白水平的检测与定量一直是关键环节，尤其是在信号通路研究、药物筛选、基因表达调控等方向，传统Western Blot已成为实验室常规方法。然而，Western Blot也面临着许多局限性，例如步骤繁琐、重复性差、数据量有限以及对实验者操作水平依赖大等问题。如何在保证准确性的前提下，提升蛋白检测的高通量、自动化和定量化，成为科研人员迫切关注的课题。 针对这一需求，LI-COR Biosciences公司推出的 ODYSSEY® In-Cell Western（ICW） Assay 技术，以其简便、高通量、可重复性强和真正定量的优势，成为蛋白检测新趋势的代表，尤其适用于高通量筛选和表型分析。In-Cell Western™可以让您直接在培养细胞的微孔板中进行多种目标蛋白的相对定量或准确定量的测定。同时，Odyssey搭载着专为处理WB数据而生的Empiria Studio软件（与各大期刊杂志合作研发）协助您在10分钟内完成对整板数据的分析处理。本文将从原理、优势、应用案例和实验流程等多个维度，全面解析这项革新性的细胞水平蛋白检测技术。 In-Cell Western 实验原理 In-Cell Western™实验利用抗原抗体特异性结合的原理，在96或者384孔板内对细胞内目标蛋白进行特异性一抗及近红外荧光二抗标记，实现对目标蛋白定量分析的技术，如图所示。 实验流程 ①以一定密度在96/384孔板上培养细胞； ②生长到合适密度后，加药物或其他处理； ③加入多聚甲醛进行固定； ④加入Triton X-100对细胞进行透化处理； ⑤封闭30min； ⑥加入一抗孵育； ⑦加入荧光标记二抗孵育1h，洗涤，Odyssey成像检测。 特点 1.实验流程简单且耗时短 In-Cell Western™无需细胞裂解破碎、蛋白提取、跑胶、转膜等一系列操作。仅需于微孔板中培养细胞，在处理好的细胞上进行固定、透化、封闭、一抗、二抗、成像等步骤。大大压缩了传统Western Blot实验用时，可在5个小时内得到384个样本的WB结果。 2.高通量 传统WB一块胶10个样品，而In-Cell Western™最多可实现一块微孔板384个样，相当于26块聚丙烯酰胺凝胶所能容纳的样品量。样品通量的提高，不仅仅意味着一次可以处理更多的样品，可以覆盖更广的浓度梯度，可以在一块板上完成样品、阴性对照、阳性对照的同时检测，更可以大幅度节约实验人员的时间。 3.重复性和准确性高 In-Cell Western™与传统Western Blot具有相同的信号增减趋势，但却比传统的Western Blot有更高的重复性和更好的准确度。用传统的Western Blot方法，在两张膜上分别检测GAPDH和PMLC20这两种蛋白，每张膜各进行13次重复，CV值为 0.27；用In-Cell Western™法进行30次重复，CV值为0.08-0.16。 4.应用广泛 在实际应用中，In-Cell Western™已被用于分析：蛋白质磷酸化（化合物对信号通路的影响；信号转导动力学；IC50测定）；GPCR激活分析；Tau蛋白的累积和抑制；基因表达水平；病毒载量；细胞凋亡；细胞表面蛋白和受体；细胞增殖检测；RNAi效率，高通量药筛等多个方向。 Part 1 这篇文章主要是关于强直性肌营养不良症1型（DM1）的研究，重点在于开发一个用于药物筛选的体外平台。研究人员通过多种细胞模型来深入表征DMPK和MBNL1的表达情况。研究发现，在DM1的永生化成肌细胞和成肌管中，DMPK蛋白水平降低，MBNL1蛋白水平也较低；而在成纤维细胞中未观察到显著差异。此外，成肌细胞分化过程中，DMPK mRNA表达增加，导致MBNL1更多地被截留。这项研究为DM1的药物筛选和模型表征提供了一个有效的平台，并指出成肌细胞和成肌管比成纤维细胞更适合用于筛选靶向DMPK和MBNL1的分子。总之，该研究有助于加速DM1治疗的体外评估和治疗开发。 文章中使用Odyssey®M成像仪进行In-Cell Western（ICW）实验，研究人员能够定量比较控制组和DM1患者细胞中DMPK和MBNL1蛋白的表达差异，如图1&2所示。发现与对照组相比，DM1永生化成肌细胞和成肌管中的DMPK蛋白水平降低，同时所有DM1成肌细胞和成肌管中的MBNL1蛋白水平也较低，如图2所示。 图 1. In-Cell Western工作流程和实验设计。(A) 细胞培养和 In-Cell Western 流程示意图，用于成纤维细胞和肌管中的蛋白质定量。(B) 用于细胞培养表征或三种不同浓度（C1、C2、C3）ASO 测试的孔板设置示例。 图2.DMPK和MBNL1蛋白在不同细胞模型中的表达水平。(A)&(C)定量分析结果显示，在DM1永生化成肌细胞（DM-ImM-1、DM-ImM-2、DM-ImM-3）中，DMPK和MBNL1蛋白的表达水平显著低于对照细胞系（CTRL-ImM-1、CTRL-ImM-2、CTRL-ImM-3）。(B)&(D)展示了DMPK和MBNL1蛋白的荧光信号强度，这些数据进一步验证了ICW方法的可靠性和准确性. Part 2 这篇文章主要研究 Kinin B1受（B1R激动剂des-Arg9-bradykinin（DBK)对血脑屏障(BBB)通透性的影响。研究发现，DBK能够短暂开放健康和胶质母细胞瘤环境下的BBB，持续时间小于48小时，从而增强化疗药物如多柔比星（DOX）在脑实质和胶质瘤中的生物利用度。研究还揭示了B1R与TLR4之间的相互作用，并提出这种相互作用可能成为增强BBB通透性和脑部药物递送的潜在治疗靶点，有助于开发更有效的脑部肿瘤治疗策略。 在这篇文章中，作者使用了 LI-COR Odyssey对细胞内的蛋白水平进行检测，具体方法是通过In-Cell Western assay来分析B1R和TLR4的蛋白表达情况。在CMT98G和CMU87条件下，B1R的蛋白表达没有显著变化，但在CMT98G和CMU87条件下，TLR4的蛋白表达显著降低。DBK的加入对 B1R蛋白表达没有影响，但对于TLR4蛋白表达，其在CMT98G和CMU87条件下的降低趋势依然存在，这表明胶质母细胞瘤细胞培养基对TLR4的表达有抑制作用。这些结果表明，胶质母细胞瘤细胞培养基对内皮细胞中TLR4的蛋白表达具有抑制作用，而DBK的加入并未改变这一趋势。同时，B1R的mRNA和蛋白表达在胶质母细胞瘤细胞培养基的影响下表现出不同的调控模式。这些发现有助于理解B1R和TLR4在胶质母细胞瘤微环境中的作用机制，以及DBK对其可能的影响。如图3所示。 图3.使用 In-Cell Western 检测法对 HBMEC 细胞中的 B1R 和 TLR4 进行相对定量分析。 LI-COR Biosciences公司的Odyssey®近红外激光成像系统可以实现定量Western Blot检测，具有重复性好、定量准确、 多色荧光成像、背景低、灵敏度高、可直接检测、应用范围广等多种优势，其不仅可以进行孔板的In-Cell Western™检测，还可以实现近红外荧光Western Blot、可见荧光Western Blot 、蛋白胶成像、核酸胶成像、EMSA、In-Gel Western、On-Cell Western™、组织切片成像、转染效率评估等多种应用。 基因有限公司作为LI-COR产品中国区代理商，为您提供专业的近红外成像解决方案、提供更多应用咨询及技术支持。欲进一步了解详细内容，请扫码联系基因有限公司工作人员吧。 关于基因 基因有限公司成立于1992年，是一家提供生命科学科研仪器、试剂耗材和技术服务的综合服务商。基于“Gene Brightens Every Life • BioTech Connects the World”——“基因燃亮生命 • 生物技术连接世界”的愿景，专注于生命科学领域前沿技术的引进和推广，致力于推动该领域国内科研机构硬件水平及实验方案的革新与升级。同时，公司也一直致力于自主品牌的科研设备的研发与生产，拥有一系列通用性强、互补性高的自主品牌产品。 基因的服务网络遍及全国各地十多个大中城市，拥有包括仪器销售，试剂销售，市场与技术支持，维修，客服，物流等多个部门组成的完整服务体系。 我们希望通过不懈努力，为您的成功铺路搭桥，也为中国的生命科学事业赶超世界先进水平尽一己之力。欲了解更多信息，请访问www.genecompany.cn。
