预染蛋白Marker能实时追踪电泳进度，堪称Western Blot的“导航仪”，但用不好反而会“迷路”——条带模糊、缺失、上宽下窄/下宽上窄、颜色异常……本文从弥散、缺失、小分子不显、颜色异常、转膜失败五大痛点出发，深度解析预染Marker的隐藏“雷区”，附独家解决方案，实验人速速收藏！

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• 上样量过多  上样量过多会导致蛋白在凝胶中扩散不均匀，从而出现弥散现象。建议减少上样量，按照说明书来操作。

• 电泳条件不当 电压过高或电泳时间过长会导致电泳缓冲液温度升高，进而使蛋白条带弥散。建议根据产品说明书调整电泳条件，避免长时间高电压运行。

• 胶浓度问题 凝胶浓度过低可能导致小分子蛋白弥散，而过高则可能影响大分子蛋白的分离。建议根据蛋白Marker的分子量范围选择合适的凝胶浓度。

自制凝胶浓度推荐（图片源自CST）

• 缓冲液问题 电泳缓冲液陈旧或pH值不在缓冲范围内，也可能导致条带弥散。建议使用新鲜的电泳缓冲液，并在使用前预冷缓冲液。

• 边缘效应 如果蛋白Marker放置在凝胶的边缘泳道，可能由于边缘效应导致条带变形或弥散。建议条件许可的条件下，尽量避免边缘条带。

• 凝胶浓度选择不当 凝胶浓度过低可能导致小分子量条带无法很好地分散，而过高则可能使大分子量条带无法充分展开。建议根据蛋白Marker的分子量范围选择合适的凝胶浓度。

• 电泳时间不足或过长 电泳时间过短可能导致部分条带未能完全分离，而过长则可能使条带跑出凝胶。建议在溴酚蓝前沿刚跑出胶时停止电泳。

• 蛋白Marker降解 如果蛋白Marker本身降解或在电泳过程中降解，可能导致条带缺失。建议检查Marker的有效期和保存条件，避免反复冻融。

电泳及转膜后均无55KDa 条带

• 样品污染或交叉污染 如果相邻泳道的样品污染了Marker，可能导致条带异常。建议在操作过程中使用干净的试剂和耗材。

• 转印方式选择不合适 预染Marker的>100 kDa蛋白需湿转（250 mA, 2小时）或半湿转转膜时间推荐（图片源自CST）干转（25 V, 30分钟），且注意半干转易遗漏大分子。

湿转转膜时间推荐（图片源自CST）

• 转印膜选择不当 0.45 μm PVDF膜孔径大，小分子预染蛋白（如10 kDa）易穿透，建议更换0.2 μm膜或硝酸纤维素膜。

• 凝胶浓度问题 小分子蛋白需要较高浓度的凝胶才能有效分离。如果凝胶浓度过低，孔径会过大，小分子蛋白可能会快速迁移，导致条带弥散或无法清晰分离。因此，在分离小分子蛋白（如小于25 kDa）时，通常建议使用较高浓度的分离胶，例如15%或更高的浓度。

• 电泳条件不当 电泳时间过长可能导致小分子蛋白条带跑出凝胶。可通过调整电压和时间、优化凝胶浓度、调整上样量以及定期更换电泳缓冲液等方式已达到缩短电泳时间的目的。

• SDS结合不充分 小分子蛋白与SDS结合较少，在电场中迁移时容易弥散。建议优化电泳条件，如使用高浓度凝胶分离，增加浓缩胶比例以及控制电泳温度以免过度加热，增加样品上样量等。

• 保存和使用问题 预染蛋白Marker保存不当（如反复冻融、暴露在高温或强光下）可能导致部分条带降解或颜色褪去。建议妥善保存Marker，并避免加热。

• 设备问题 电泳槽内存在气泡、电极连接不正确或电泳槽温度不均匀，可能导致条带显示异常。建议检查电泳设备，确保其正常运行。

• 缓冲液问题 转膜缓冲液中甲醇浓度过高（>20%）可能剥离预染蛋白的染料，使条带变淡或丢失。建议根据实验需求调整甲醇浓度至10%-15%，以确保转膜效果和条带清晰度。

1、为什么Marker条带上宽下窄或者上窄下宽？

2、蛋白Marker会影响标签蛋白的检测吗？

3、Marker指示的蛋白大小和理论值有差异？

4、预染蛋白Marker 能不能用于非变性胶？

5、预染蛋白Marker 的“隐匿神坑”都有哪些？