MERFISH 技术采用组合光学条形码，结合单分子FISH能够识别成千上万种不同的 mRNA 分子。然而，要解码这些条形码，来自不同分子的荧光信号必须是光学可分辨的。对于传统的高分辨率光学显微镜来说，每立方微米只能分辨出少量分子，真核细胞的转录组可满足此限制进行目标检测。相比之下，一个对数生长期的大肠杆菌细胞约含有8000个 mRNA 分子，细胞体积约为3 μm³，使得 mRNA 的总密度几乎比可用衍射极限成像分辨的密度高出三个数量级（图1A），因此限制了对细菌 mRNA 的成像，成为转录组规模成像的一个重大挑战。

为克服细菌 mRNA 的密度问题，研究人员利用膨胀显微技术开发了一种针对细菌 FISH 优化的膨胀工具箱，能够实现高达1000倍的体积膨胀（图1B）。简而言之，将大肠杆菌培养到中期，用多聚甲醛（PFA）固定，消化细胞壁，在10倍稳健膨胀（TREx）凝胶中膨胀，然后将样品重新包埋在不膨胀的稳定凝胶中。该次膨胀使大肠杆菌宽度增加3.7±0.8倍，由于这种线性膨胀与~50倍的体积膨胀一致，将这种方法称为50X膨胀方案。在用97个操纵子库染色的膨胀细胞中，可以看到单个荧光点，并用MERFISH对这些分子进行鉴定（图1，C-H），表明膨胀足够解决该目标文库的mRNA密度问题。

利用1057 个操纵子的 MERFISH 探针组对 50X 膨胀的大肠杆菌进染色仍能分辨出单个颗粒， 但RNA 信号重叠的频率有所增加。为了应对这种重叠，研究人员开发了一种迭代膨胀实验方案，用50X膨胀和稳定的细胞在第二种TREx凝胶中膨胀，然后包埋在第二种稳定凝胶中。该方案使细胞宽度扩大11.1±2.2倍，由于这种线性膨胀与~1400倍的体积膨胀一致，将这种方法称为1000X膨胀方案。当用该方案膨胀细胞时，染色1057个操纵子可以清楚地区分来自单个RNA的信号及其身份（图1，I-K）。

图1. 利用细菌-MERFISH对大肠杆菌中数千个操纵子的图像表达谱分析

细菌单细胞转录组学的一个有前景的方面是能够识别异质细菌行为，并通过计算重新同步单个细胞对环境刺激的不同步反应，揭示被群体平均掩盖的动态。研究人员利用细菌-MERFISH重新审视了经典的双相生长现象，在葡萄糖和木糖的混合物中培养大肠杆菌。正如预期，细菌培养在葡萄糖耗尽之前呈对数生长，在碳源切换时暂停生长，然后在木糖上恢复对数生长，最终在两种糖都耗尽后进入稳定期（图2A）。研究人员在这个过程中收集了大肠杆菌细胞，以50X膨胀分析了1057个操纵子的表达（图2，A-C）。

为了探索大肠杆菌转录组的空间组织，利用了在肉汤培养基（LB）中生长的 50 X膨胀的 1057 个操纵子的测量数据。为确定细胞内RNA定位，将每个mRNA分子映射到每个细胞的轴向和径向位置，并将这些坐标归一化为细胞长度和宽度(图3A)。然后计算每个mRNA在所有测量细胞中的平均轴向和径向分布(图3，B-D)。研究人员鉴定了在细胞质（例如dnaKJ）、膜（例如ptsG）和极区（例如dnaB）富集的mRNA（图3，C和D），并注意到这些主要模式的多样性变化，mRNA在膜的不同位置、在多个细胞质位置或在单个中心焦点上富集（图3E）。为避免样本膨胀引入的失真，作者利用未膨胀的 smFISH 对少量操纵子进行验证，观察到了高度相似的定位模式（图3F）。

研究人员利用人类肠道共生菌B. theta单定植的无菌小鼠（图4A）探索细菌-MERFISH在复杂的空间结构环境中分析基因表达的能力。B. theta可能会根据局部多糖的可用性调节其多糖的利用，因此设计了一个涵盖多糖利用位点（PUL）内的多种转运蛋白、通常与PUL表达调控相关的混合双组分系统（HTCS）以及少量与中央代谢和其他细菌功能相关的基因panel，总共针对 159 个操纵子（图 4B ）。

细菌-MERFISH是一种基于图像的单细胞转录组学方法，通过将优化的膨胀显微工具箱与MERFISH相结合，克服了细菌细胞内大量mRNA的密度的挑战。可以成像大量的细胞，将基因表达与细胞形态或细胞内分子组织联系起来，在原位描述细菌的行为。无论是单一物种生物膜内特殊细胞状态之间的相互作用，还是混合群落中不同物种之间的相互作用，细菌- MERFISH都提供了一种将空间临近性、细胞微环境和整体结构与基因表达联系起来的方法。