1981年，美国FDA批准了首个治疗性单克隆抗体（mAb） muromonab-CD3用于临床。迄今全世界已经批准了190多种治疗性抗体药物，还有数百种正在开发中。

    传统的单克隆抗体生产方法，如杂交瘤技术和表面展示技术是低通量、耗时和资源密集型的。‍表面展示技术需要对片段进行繁琐的亚克隆，使其变成可溶的形式，从而导致最终文库的多样性丧失。这两种方法都不需要已知靶点的结构来进行抗体开发，从而导致下游安全的不确定性⁵。

    利用基于微滴的技术，Cyto-Mine®可以将数千万个单细胞封装到单个微滴中，检测目标抗原，筛选罕见的抗原特异性ASCs，并将单个细胞分配到96或384孔微滴板（MTPs）中，以便在一天内进行下游功能分析。

传统工作流程与Cyto-Mine®工作流程。Cyto-Mine能够显著提升通量和效率。

    本篇内容展示了默克公司的研发科学家如何使用Cyto-Mine®从啮齿类动物或人类供体中分离的B细胞中快速识别、筛选并获取抗体分泌、特异性结合重组抗原或抗原阳性的细胞，并直接用于功能研究⁹。

    从健康供者接种破伤风类毒素（TT）后6或7天的外周血中分离出人浆母细胞。进行外周血单核细胞（PBMCs）的分离并富集CD38+的B细胞。

    原代小鼠重组经破伤风类毒素片段(TT-CTD)C端结构域或肿瘤相关抗原（CAR）的细胞外结构域进行免疫刺激，5天后富集进行骨髓，淋巴结和脾的CD138+浆细胞富集。

    分离的人类CD38+或小鼠CD138+细胞转移到新鲜的细胞培养基，为Cyto-Mine®分析做准备。

B细胞获和分离、筛选及验证的总体工作流程。

        为了分选分泌抗原特异性抗体的浆细胞，将100万个ACSs重悬于1ml包裹培养基中，如表1所示。FRET实验用于筛选抗体分泌和重组抗原结合，包裹培养基中含有AlexaFluor488标记的TT-CTD和Goat F（ab’）2 Anti-Human IgG-（Fab’）2 （DyLight-594）作为FRET的供体和受体，用于筛选分泌TT抗体的CD38+细胞（图1）。

    为了分选分泌抗生物素化CRA抗体的小鼠浆细胞，将CD138+细胞重悬于1ml包裹培养基中，包裹培养基中分别用标记有生物素化CRA的Streptavidin-AF488和Goat F(ab’)2 Anti-Mouse IgG – (Fab’)2 (DyLight® 594)作为FRET供体和受体。

表1.微滴包裹培养基组分。

图1.使用Cyto- Mine®微滴为基础的FRET IgG分泌实验。该示意图显示了筛选IgG分泌细胞的标准试验。在封装过程中，在每个微滴内捕获一对定制的IgG特异性荧光探针。被包裹的阳性细胞分泌的IgG被检测探针对识别，形成一个3体FRET复合物，诱导荧光信号的移位。

    Cyto-Mine®的工作流程将单细胞包裹、孵育、筛选、分选、分离和目标特异性ASCs的验证集成在一个全自动过程中（图2）。100万个ASCs的细胞悬液通过40 μM的细胞过滤器过滤，然后移液到Cyto-Cartridge™中，并装入Cyto-Mine®以启动细胞包裹。将1 mL的细胞包裹在240万个450 pL液滴中，立即在37°C原位孵育，使微液滴内的抗体分泌达到可检测水平，从而形成FRET信号。小型化的格式可以实现灵敏，快速的测定。一般0.5至2小时抗体滴度达到可检测水平，具体取决于细胞群的抗体生产速度。

       Cyto-Mine®测量每个微滴的荧光，以类似于流式细胞术的方式，抗原阳性hit被分类收集并储存在分配前的冷冻微室中。在分配之前，Cyto-Mine®对每个液滴连续成像5次，提供单细胞祖细胞的视觉证据，随后液滴进入预先填充裂解缓冲液的96或384孔板的单孔中。

图2.Cyto-Mine®工作流程将抗原特异性克隆的筛选、分选、分离和验证集成到一个全自动过程中。

    作为Cyto-Mine的高通量和血浆原细胞人类多样性挖掘能力的一个例子，从TT疫苗接种者的外周血中纯化的300万个ASCs在纯化当天或冷冻5天后进行TT抗体特异性分泌筛选（分别图3A和B）。对1000个液滴进行抗原特异性分选，433个液滴作为单细胞被分配至多孔板的单孔中，进行单细胞PCR分析提取IgG序列，随后使用生物层干涉法（BLI）确认特异性结合验证（图3C）。

    下游分析显示，基于Cyto-Mine®的抗体发现流程在不到1个月的时间内成功地从接种过TT疫苗的人供者外周血富集的血浆母细胞中获得了44个序列多样且高亲和力的全人TT抗体（表2）。

图3.对新鲜来源和复苏的人类ASCs进行TT靶特异性分选。（A)人ASCs和（B)复苏的人质母细胞。通过FRET实验结果的绿色荧光减少，红色荧光增加则表明分泌抗TT抗体。（C)通过BLI的TT结合亲和力显示，从ASC来源的4周内通过Cyto-Mine®获得的结合物主要是亚纳摩尔级别的TT亲和力。

    为了证明上述的简化工作流程同样适用于评估啮齿动物免疫多样性，对CRA预免疫的啮齿动物中分离的ASCs进行了相同的筛选过程。使用Cyto-Mine®的微滴技术可以将CD138+浆细胞包裹在液滴中，然后在单细胞水平上进行抗原特异性筛选（图4）。在筛选的液滴中，发现2300个液滴含有抗原特异性ASCs。从中选择635个进行进一步的下游分析。这一过程产生了98个完整的单克隆抗体基因PCR扩增子，然后进行亚克隆和生产。其中，30例被证实是特异性靶标（表2）。

图4.根据CRA靶特异性对新鲜和复苏小鼠ASCs进行分选。A)新鲜获得的鼠浆细胞分选分泌CRA特异性抗体细胞。B)对分选的微滴进行分配，已分配的液滴用浅蓝色表示，未分配的液滴用灰色表示，在分配过程中作为阴性参考信号。以阳性信号的位置确定合适的门控范围。C)冷冻复苏的浆细胞进行CRA特异性分选。这些抗体命中的统计数据如表2所示。

表2. 利用Cyto-Mine®筛选人和小鼠的靶特异性ASCs的统计数据。TT：健康疫苗接种者CD38+细胞筛选；CRA：WT小鼠CRA免疫刺激后MACS的骨髓、淋巴结和脾脏CD138+浆细胞筛选。

    总之，这些数据显示了Cyto-Mine®有效筛选数百万原代B细胞的能力，使默克研发的科学家能够识别高度特异性的TT和CRA抗体。整个抗体发现过程仅在28天内完成，其中Cyto-Mine®在第1天用于抗原特异性B细胞的快速筛选、分离和单细胞分析，随后27天用于基因合成、单细胞克隆、生产和验证。与传统的B细胞挖掘方法相比，Cyto-Mine®能够在细胞分离当天内进行高通量筛选。

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2. Antibody Society. Antibody therapeutics product data. Available at: https://www. antibodysociety.org/antibody-therapeuticsproduct-data/ [Accessed 3 October 2023]

3. Mitra, S. and Tomar, P.C. (2021). Hybridoma technology; advancements, clinical significance, and future aspects.Journal of Genetic Engineering &Biotechnology, 19(1), p. 159

4. Ministro, J., Manuel, A.M. and Goncalves,J. (2020). Therapeutic Antibody Engineering and Selection Strategies.Advances in Biochemical Engineering/Biotechnology, 171, pp. 55-86

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Cyto-Mine®平台特点