免疫疗法目前已成为人类对抗癌症的新希望，其中 CAR-T 细胞疗法又是其中更耀眼的新星，CAR-T 是嵌合抗原受体 T 细胞(Chimeric Antigen Receptor T-cell) 的缩写。基因工程改造 T 细胞使之能特异性识别肿瘤抗原，起到高效杀伤肿瘤的作用。

2017年8月31日, FDA 正式批准由诺华研制的全球首个 CAR-T 细胞药物 Kymriah  (Tisgenlecleucel,  CTL-019) 上市，该里程碑式事件标志该类细胞疗法的时代将正式开启，但目前面临的难题还有很多，例如 CAR-T 在治疗血液系统癌症中取得了较大成功，但在实体瘤应用领域还是有很大难题，虽然有文献报道的 CAR-T 治疗恶性肉瘤和脑胶质瘤的成功案例，但客观反应率和疾病控制率都不如血液瘤理想。

其主要原因是：

Ÿ   T 细胞肿瘤趋向性不足

Ÿ   缺乏理想的抗原靶点

Ÿ   肿瘤微环境免疫因子的负向调节作用等。

而传统的单层培养从培养环境到细胞状态都不能模拟 CAR-T 的杀伤效果，因此急需建立可靠的更能模拟实体瘤环境的 3D 体外筛选模型对 CAR-T 浸润、杀伤效果和特异性（毒性）进行评估。

然而，3D 培养模型面临诸多困难，要获得大小形态均一的 3D 培养物就十分困难，珀金埃尔默有专业的建立 3D 微组织培养的系统，U形超低吸附培养板 CellCarrier™ Spheroid ULA和InSphero GravityPLUS悬滴式培养系统，以CellCarrier™ Spheroid ULA微孔板为例，微孔板涂层为合成材料，细胞附着性极低，有利于形成均一的单个球状微组织，如下图所示。

微组织培养 1-2 天后可以通过成像的方法检测细胞杀伤和通过试剂盒检测细胞总活率

结果展示

1. CAR-T 细胞对 3D 培养的 SKOV3 卵巢癌细胞微组织的杀伤效果

该实验样品由上海细胞治疗研究院提供，上海细胞治疗院利用自表达 PD-L1 抗体的 CAR-T 细胞增强免疫治疗效果。下图中左图为 CAR-T 细胞作用组，右图为对照。SKOV3 肿瘤细胞为蓝色，CAR-T 细胞为绿色，死细胞被PI染成红色，分别采集 0h、2h、4h、6h 和 24h 的细胞影像，并分析不同时间点的死肿瘤细胞占所有肿瘤细胞的比例，及不同时间点 PI 的荧光强度。

CAR-T细胞处理组的肿瘤细胞死亡率随时间和剂量呈增加趋势，而对照组没有影响。

2. 基于 ATPlite 1step 3D 试剂盒的细胞活力均相检测法

ATP 是细胞代谢活性的指标分子，当存活的细胞数越多时，其细胞内的 ATP 含量也就越高；相反的当细胞坏死或凋亡时，细胞内的 ATP 浓度快速下降，因此可以藉由检测细胞内的 ATP 含量作为细胞存活或生长速率的指标 。珀金埃尔默公司针对 ATP 检测所推出的 ATPlite 1 step 3D 试剂盒 ，可以高效裂解 3D 微组织，释放其中的 ATP，试剂盒中的 D-Luciferin 在 Luciferase 的催化下与 ATP 发生反应，释放光信号。原理如下：

在 CAR-T 介导的实体肿瘤杀伤模型中，可以用这种检测细胞裂解液中细胞活力的方法反应杀伤效果。

如下图所示，A) 为 3D 微组织用 ATP 检测试剂盒测得的细胞活力与种板细胞数之间的相关性，B) 为用 Operetta 高内涵系统分析的 3D 微组织截面积与种板细胞数的相关性。

当然这是只有肿瘤细胞的前提下，在加入 CAR-T 细胞后，实际 ATP 总量必然是两种细胞的总和，更合理的对照设置应该是加入同等数量未经改造的 T 细胞，从而反映 CAR-T 对肿瘤细胞活力的影响。

该方法的优点与传统的细胞定量方法相比，更适合用在 3D 微组织样品上，因其转为 3D 微组织研发的高效裂解液，使得检测灵敏度高、操作分析都非常简单，是影像分析法的有效补充。

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