本研究采用scRNA-seq分析中的常用指标对这几个空间基因组学数据集进行评估，包括重复实验的一致性分析，以及每个细胞中鉴定出的特征和RNA计数平均值等指标，如图1所示。结果显示每种技术都表现出很高的可重复性，Pearson相关系数为0.894-0.999；由于基因panel大小在不同技术中差异很大，使得对于灵敏度的评估具有很高的挑战性，但总体发现，共同靶向基因的平均表达水平在不同技术中的分布是相似的，并且观察到MERSCOPE靶标中极低表达基因（如G蛋白偶联受体GPCRs）的富集，这表明MERSCOPE在有效检测低表达基因方面的卓越能力。

图1.不同原位基因表达技术的分析示意图以及基因表达分位数显示。

      为评估这几种技术的检测特异性，本研究采用scRNA-seq数据集中非特异性的金标准测试方法“barnyard”实验（即混合人鼠细胞）以识别假阳性分子，如图2所示。首先鉴定出在scRNA-seq数据中表现出互斥表达的基因，如Slc17a7（兴奋性神经元）和GFAP（星形胶质细胞）几乎从未在同一细胞中共同表达，并在六个数据集中进行测量。为量化非特异性（假阳性），研究人员计算了每个数据集的“互斥共表达率”（MECR），互斥共表达率越高表明特异性越低。结果显示，该指标在不同技术之间存在很大差异，其中Xenium数据集在各个数据集中的比率最高，而MERSCOPE数据显示了显著更优的针对细胞类型特异性标记的分子分配特异性。

图2.每个数据集中两个互斥基因Slc17a7（兴奋性神经元标记物）和Gfap（星形胶质细胞标记物）的表达（计数）以及所有六种原位方法的MECR分析。

      由于分子分配给细胞的准确性取决于细胞分割的质量和大小，而不同技术在细胞分割的的质量和大小上存在很大差异，分割阈值的选择对于控制原位数据集的灵敏度和特异性之间的平衡非常重要，为此，本研究使用统一的分割分析算法“Baysor”重新处理了六个数据集。对于每个数据集，分割分析算法应用于约1mm x 1mm范围的大脑皮层区域数据（该区域每个细胞的分子计数较高），分析结果显示，通过改变分配概率的阈值可以改变每个数据集中灵敏度和特异性之间的权衡，而在控制特异性后，分子灵敏度在原位技术之间跨越一个数量级，其中观察到MERSCOPE的灵敏度最高，与最接近的Xenium技术相比，灵敏度提高了近两倍。虽然通常认为，采用的基因panel越大，平均到每个基因检测的效率越低，但在使用通用的分割分析算法重新分析不同技术后发现，MERSCOPE即使在更大的基因panel数量（483个）下，其灵敏度在六种技术中仍然是最高的。

图3.细胞分割的质量和大小影响分子分配的灵敏度和特异性。

• 灵敏度更高-比Xenium提高近2倍

• 对低表达基因具有更好的检测效率

• 提高了分子分配的特异性和细胞亚群分析的准确性

• 所有六种原位技术在灵敏度和特异性之间的最佳权衡