图1. Cyto-Mine®专有技术从复杂的细胞群中发现和分离高产克隆。
将B细胞或杂交瘤细胞群在其首选培养基中补充适当的抗原检测试剂。然后将细胞悬液移液到Cyto-Cartridge®中，并将Cyto-Cartridge®装入Cyto-Mine®。Cyto-Mine®将细胞包裹成300pL的微滴（每个微滴内的细胞数可以根据需求调整初始细胞密度而变化）。
然后，Cyto-Mine在原位孵育细胞，使免疫球蛋白分泌到微滴中。极小的微滴体积保证了检测的灵敏度，快速实验通常孵育时间为0.5至2小时，具体取决于细胞群产生抗体的速度。
阳性微滴随后被分选和收集。图2总结了Cyto-Mine抗原特异性分析的大体步骤。
图2. Cyto-Mine®工作流程集成自动化地筛选、分选、分离和抗原特异性克隆验证。
Cyto-Mine®的一个关键特征是无需事先对细胞进行修饰，在细胞保持最高活性的状态下，分析数百万细胞分泌免疫球蛋白的抗原特异性。图3展示了阳性微滴中的检测。探针对( 荧光基团偶联的抗原 和 免疫球蛋白特异性受体探针)与分泌的抗原特异性免疫球蛋白结合，诱导FRET荧光位移。然后Cyto-Mine®测量产生的荧光信号并将其转化为定量输出。受体探针的选择允许同时筛选抗原特异性和同型免疫球蛋白。
图3.基于微滴的Cyto-Mine抗原特异性检测。该模型显示了筛选抗原特异性IgG的标准试验。在孵育期间，被包裹细胞分泌的抗原特异性IgG被抗原和IgG特异性受体探针识别，形成一个3体FRET复合物，诱导荧光信号。
为了确认Cyto-Mine®抗原特异性检测是定量的，采用人TNF-α作为模型抗原进行了滴定实验。在细胞培养基中加入5种不同浓度的anti-human TNF-α IgG (最高20mg/mL，相当于133nM)，再分别包裹成含有TNF-α和IgG特异性检测探针的微滴。然后将这5群微滴混合上机，测量抗原特异性。结果如图4所示，显示了如何将不同的抗体滴度分解为离散的种群，图5所示的滴定曲线表明，该分析是特异性且定量的。
图4.Cyto-Mine®散点图。大量的特定浓度的Anti-Human TNF-α IgG被载入单个微滴，然后使用Cyto-Mine®抗原特异性测定和分析。
图5.Cyto-Mine®生成具有代表性的抗原特异性滴定曲线。在本例中，Control IgG证实了检测人TNF - α的特异性。
用人类TNF-α免疫的小鼠产生的杂交瘤细胞在Cyto-Mine®上运行以寻找TNF-α特异性克隆。细胞群与荧光偶联的人TNF-α和Anti-mouse的IgG-Fc受体探针混合，运行Cyto-Mine®抗原特异性分析工作流程。结果如图6所示，高受体/供体荧光比例的细胞群被圈门收集。右下角椭圆形集群表示大量阴性微滴，其中包含空的微滴和含有非抗原特异性细胞或不产生免疫球蛋白细胞的微滴。本实验圈门分选了所有抗原阳性的克隆， 该门控范围可以自行设置以适应不同实验需求。
图6. Cyto-Mine® 散点图显示了包裹在微滴中的杂交瘤产生的 FRET 信号，并筛选出分泌抗人 TNF-alpha 特异性 IgG 的细胞。
