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Cyto-Mine---助力快速有效的原代B细胞筛选
背景介绍 The Background 与传统的杂交瘤技术相比，单个B细胞筛选的高通量技术在治疗性抗体的发现过程中提供了许多优势。由Köhler和Milstein在1975年引入的杂交瘤技术已经被FDA获批并有着治疗性抗体的较高成功率。然而，这项技术的一个最显著的局限性是高通量的筛选命中率低。只有一小部分分泌抗体的动物免疫B细胞群被筛选出来，许多关键的抗体分泌细胞在细胞加工和融合过程中丢失。因此，可以筛选整个B细胞群的技术的发展是至关重要的，以确保关键目标特异性抗体分泌细胞不会被错过。 Cyto-Mine新型微滴技术提供一个了强大的高通量平台，用于在仅仅两天内筛选整个B细胞库中的抗原特异性抗体分泌B细胞，同时保证细胞活性。Cyto-Mine可以通过一次包裹多达4000万个细胞，测定靶抗原，选择抗原特异性抗体分泌细胞，以及将单细胞分配到96或384孔板中，从而高效筛选具有抗原特异性的抗体分泌细胞。
Method Cyto-Mine 样本制备 将来自免疫小鼠的冷冻淋巴细胞解冻并用新鲜培养基洗涤重悬。如表1所示，细胞悬液通过30μm细胞过滤器过滤，以去除细胞团块或碎片。然后使用封装培养基对细胞进行计数并稀释至所需的工作浓度。向1mL 细胞样品中加入 IgG 或抗原特异性FRET测定试剂。然后将样品转移到Cyto-Cartridge 中，并装入Cyto-Mine 中。 表1 Cyto-Mine® 工作流程
Cyto-Mine 首先将细胞包裹在450pL微滴内(图1)。微滴包裹效率根据细胞的稀释水平进行了优化。包裹后，将细胞孵育至可检测的分泌抗体水平，并使用先前开发的测定方法进行测定以鉴定分泌的抗体。在两天内的不同时间段利用IgG和抗原特异性测定进行筛选。Cyto-Mine 选择性地对高产B细胞进行分选，随后分配到微滴板的单个孔中，并同时会对微滴进行成像以确保单克隆性。
图1 单个细胞或每微滴多个细胞的包裹 A)在培养基中将大量细胞(大于100万)稀释至1 × 108个细胞/mL 的浓度，导致每个微滴中有多个细胞 B)将细胞稀释至1x106个细胞/mL 的浓度，以保证每个微滴中大部分为1个细胞
Cyto-Mine® 分析
Cyto-Mine的关键分析功能之一是它能够检测每个细胞中抗体的特定分泌。起始细胞群在装载到Cyto-Mine之前，与适当的检测探针对混合。检测探针与感兴趣的分泌抗体结合，诱导FRET介导的荧光信号，如图2和图3所示。
图2 使用基于Cyto-Mine微滴的FRET IgG分泌测定法检测阳性克隆。在微滴包裹过程中，定制的一对IgG特异性荧光探针被包裹在每个微滴内。被包裹细胞分泌的IgG被形成的FRET三联体复合物的检测探针对识别
图3 基于细胞微滴的FRET抗原特异性分析法读出阳性事件。由荧光抗原和荧光 IgG 探针组成的定制探针对在包裹期间被捕获在每个微滴内。只有包裹细胞分泌的抗原特异性IgG被形成诱导荧光信号偏移的三体 FRET 复合物的检测探针对被识别
结果 分析验证
首先用Cyto-Mine分析从小鼠淋巴结分离的B细胞样本，以鉴定含有IgG分泌细胞的微滴。其次，确定分泌的抗体是否可以被抗原特异性检测探针检测到。图4显示了来自两个独立测定的结果，其中分离的B细胞被检测到分泌一般 IgG (左图)或靶抗原特异性抗体(右图)。
图4 散点图中的每一个都显示了用不同的测定方法获得的阳性群体的代表性例子，这些测定方法表明测定探针与分泌的抗体的结合
B细胞库的有效筛选
第一轮筛选
为了检测所有的IgG分泌细胞，使用 IgG FRET分析对3900万个细胞库进行了第一轮筛选。将多个细胞包裹在微滴中，并对阳性微滴分选，然后根据汇集的微滴分配方案将其分配到6孔板的单孔中。鉴于包裹导致所有微滴都含有多个细胞，阳性率为0.22% ，只有少部分细胞积极分泌 IgG (图5)。在整个工作流程中记录细胞活力，如图5和6所示，Cyto-Mine 在分析和孵育期间保留了原代 B 细胞的活力，证明了该平台与原代细胞的两轮筛选的兼容性。
图5 多重B细胞筛查 图6. Cyto-Mine运行后的原代B细胞活力测定
第二轮筛选 过夜培养后，用抗原特异性FRET分析完成第二轮筛选，以检测分泌特异性抗体的细胞。这次筛选是将单个细胞包裹在微滴中，阳性微滴被分配到含有裂解缓冲液的孔中(图7)。如图8所示，实验成功地重复了3次，表明此方法的可行性。 图7. 单个 B 细胞筛选 图8. 单个B细胞重复筛选实验
结论 以上数据显示出Cyto-Mine有效筛选整个B 细胞库的能力，既能鉴定分泌抗体的细胞，又能分离分泌抗原特异性抗体的罕见细胞。这两步的过程中，首先通过微滴包裹富集IgG分泌的单个细胞，然后使用抗原检测法来探测抗原特异性抗体并分离分泌这些抗体的罕见细胞，所有这一切工作只用了两天时间。最重要的是，在整个过程中，B 细胞的细胞活力得以维持。 Cyto-Mine 技术优势 速度 在单克隆抗体的发现和开发中加速发现抗原特异性抗体 简单 连续、集成和自动化的过程消除了对多种仪器的需要 效率 更高效的对大量抗体分泌细胞(总 B 细胞库)的深入筛选，以克服杂交瘤技术的低效率 细胞相容性 微滴包裹确保了B细胞在整个分离过程中的良好生存能力
参考文献 1. Lu, Z.-J.et al., 2012. Frontier of therapeutic antibody discovery. World Journal of Biological Chemistry, pp. 187-196. 2. Josephides, D. et al. (2020). Cyto-Mine: An Integrated, Picodroplet System for High-Throughput Single-Cell Analysis, Sorting, Dispensing, and Monoclonality Assurance. SLAS TECHNOLOGY: Translating Life Sciences Innovation. https://doi.org/10.1177/2472630319892571
基因有限公司是英国Sphere Fluidics在中国区域推广和销售的合作伙伴，在全国17个城市均有驻当地的办事处。可为您提供售前产品咨询与技术交流、售后安装、应用培训等优质服务。如果想了解更多关于Cyto-Mine的介绍，可以添加下方产品经理企业微信进行一对一沟通。 关于基因 基因有限公司成立于1992年，是一家提供生命科学科研仪器、试剂耗材和技术服务的综合服务商。基于“Gene Brightens Every Life • BioTech Connects the World”——“基因燃亮生命 • 生物技术连接世界”的愿景，专注于生命科学领域前沿技术的引进和推广，致力于推动该领域国内科研机构硬件水平及实验方案的革新与升级。同时，公司也一直致力于自主品牌的科研设备的研发与生产，拥有一系列通用性强、互补性高的自主品牌产品。 基因的服务网络遍及全国各地十多个大中城市，拥有包括仪器销售，试剂销售，市场与技术支持，维修，客服，物流等多个部门组成的完整服务体系。 我们希望通过不懈努力，为您的成功铺路搭桥，也为中国的生命科学事业赶超世界先进水平尽一己之力。欲了解更多信息，请访问www.genecompany.cn。
