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【NEB上新啦！】告别重亚硫酸盐——看ta如何用酶学转化法特异性检测5hmC位点！
继2019年重磅推出高效替代重亚硫酸盐的酶学转化法甲基化建库试剂盒EM-seq后，NEB再次推出全球独创性产品——
NEBNext® 酶学转化法 5hmC 甲基化建库试剂盒 （E5hmC-seq™）
这是一种在单碱基水平上特异性检测5hmC位点的新方法。
通常，使用基于NEBNext EM-seq酶学转化或重亚硫酸盐转化生成的Illumina文库，可以检测修饰的5-甲基胞嘧啶（5mC）和5-羟甲基胞嘧啶（5hmC）。然而，这些方法并不能区分5mC和5hmC。
与EM-seq相同，NEBNext®酶学转化法5hmC甲基化建库试剂盒（E5hmC-seq™）使用酶学转化法特异性检测5hmC位点，不会像重亚硫酸盐转化法对DNA造成损伤，即便DNA起始量低至0.1 ng，也能灵敏地检测5hmC位点。
用于EM-seq和重亚硫酸盐测序的生物信息学分析工具也可用于E5hmC-seq。可以从EM-seq数据中减去E5hmC-seq数据，从而确定单个5mC和5hmC的精确位置。
E5hmC-seq 转化原理
在两步酶法转化过程中，首先对5hmC进行糖基化，使得5hmC在下一步脱氨基反应中被保护了起来，而未被保护的5mC和未甲基化的胞嘧啶会被脱氨基为尿嘧啶。随后使用NEBNext®Q5U®预混液（Q5®高保真DNA聚合酶的改良版）进行扩增，并在Illumina平台上进行测序。
产品优势
1. 卓越的5hmC检测灵敏度 2. 起始量范围广：0.1–200 ng 3. 更均一的GC覆盖度 4. 更高效的建库流程 5. E5hmC-seq和EM-seq数据结果可联合分析 6. 可单独购买转化模块（NEB #E3365）
部分数据结果
使用Covaris® ME220仪器将0.1 ng至200 ng人脑基因组DNA打断至350 bp，并用E5hmC-seq的起始样本，所使用的PCR循环数如图所示。使用 Agilent®TapeStation®，High Sensitivity D1000试剂测定文库产量。显示的数值是四次技术性重复的平均值，误差线表示标准差。 结果表明：不同起始量的样本均能获得高产量的E5hmC-seq文库。
使用0.1 ng至200 ng人脑基因组DNA制备E5hmC-seq文库时，插入所有胞嘧啶完全羟甲基化的T4 DNA作为标准品。使用Covaris®ME220 仪器将DNA打断至 350 bp，并用作E5hmC-seq的起始样本，构建的文库在Illumina®NovaSeq 6000（2x150 bases）上进行测序。使用bwa-meth将每个文库的19亿数据（200 ng、10 ng和1 ng）或7.15亿数据（0.5 ng和0.1 ng）与人类T2T、lambda和T4参考基因组的复合基因组进行比对。使用MmethylDackel从比对结果中提取甲基化信息。显示的数值是两次技术性重复的平均值，误差线表示标准差。 结果表明：T4 DNA标准品CpG、CHG和CHH中的5hmC检出率≥ 98.9%。
使用Covaris® ME220 仪器将0.1 ng 至200 ng人脑基因组DNA打断至350 bp，并用作E5hmC-seq的起始样本，构建的文库在Illumina NovaSeq 6000（2x150 bases）上进行测序。使用bwa-meth将每个文库的19亿数据（200 ng、10 ng 和 1 ng）或7.15亿数据（0.5 ng 和0.1 ng）与人类T2T、lambda和T4参考基因组的复合基因组进行比对，并使用MmethylDackel从中提取甲基化信息。显示的数值是两次技术性重复的平均值，误差线表示标准差。 结果表明：不同起始量的样本在CpG、CHH 和CHG中的5hmC占比相似。
使用Covaris ME220 仪器将0.1 ng 至200 ng人脑基因组DNA打断至350 bp，并用作E5hmC-seq的起始样本，构建的文库在Illumina NovaSeq 6000（2x150 bases）上进行测序。使用bwa-meth 将每个文库的19亿数据（200 ng、10 ng 和1 ng）或7.15亿数据（0.5 ng和0.1 ng）与人类T2T、lambda和T4参考基因组的复合基因组进行比对。使用Picard计算GC覆盖度，图中显示不同GC含量时（0 – 100%），标准化后覆盖度的分布情况。将人类T2T基因组的GC含量分布绘制为直方图。 结果表明：不同起始量的样本所制备的E5hmC-seq文库皆能获得均一的GC覆盖度。
使用Covaris ME220 仪器将0.1 ng至200 ng人脑基因组DNA打断至350 bp，并用作E5hmC-seq的起始样本。构建的文库在Illumina NovaSeq 6000（2x150 bases）上进行测序。使用bwa-meth将每个文库的19亿数据（200 ng、10 ng 和 1 ng）或7.15亿数据（0.5 ng 和 0.1 ng）与人类T2T、lambda 和T4参考基因组的复合基因组进行比对。使用MmethylDackel从比对结果中提取甲基化信息，以methylkit形式提供报告。使用CpG结果，针对所有起始量的E5hmC-seq文库生成CpG图谱。正义链和反义链上的CpG独立计算，在T2T基因组中分析出多达6780万个可能的CpG位点。 使用0.5 ng至200 ng的起始样本时，E5hmC-seq始终可以覆盖超过 5600万个CpG位点；即使使用0.1 ng起始样本时，也可覆盖约4800 万个位点。
采用methyKit绘制1 ng、10 ng和200 ng起始量下E5hmC-seq文库之间的相关性，19亿数据测序深度，150-base reads，最小覆盖度为1X（所有文库均使用 5,650万个CpG位点）。200 ng和10 ng起始量文库的相关性≥0.81。200 ng和10 ng起始量文库的相关性≥0.81。将200 ng、10 ng和1 ng的E5hmC-seq文库逐步向下采样至约15亿、11亿、7亿和3亿的总reads，并进行相关性分析。我们观察到，与11亿、15亿和19亿reads相关性相比，3亿和7亿reads的相关性较低。 结果表明：由于样本中5hmC信号的丰度较低，因此需要对E5hmC-seq文库进行深度测序。
在科学研究的赛道上，速度与效率是竞争力的代名词。除了这款最新推出的NEBNext®酶学转化法5hmC甲基化建库试剂盒外，不要忘记NEB的明星产品——
NEBNext UltraExpressTM 系列试剂盒！
ta能够大幅提升DNA和RNA文库制备的速度，DNA文库制备：<2小时，起始量范围广：DNA：10-200 ng（机械打断），更在保证高质量的前提下，简化实验流程，减少耗材的使用。
基因有限公司作为NEB全国一级代理，为您提供专业的产品服务！
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