NEB 最新推出的

RNase 4

作为一种新型特异性核糖核酸酶，

为RNA分析提供了有力工具！

相比于传统的单核苷酸特异性核糖核酸酶（如 RNase T1），RNase 4的精准切割能够产生更适合的寡核苷酸长度，生成大量具有独特谱型的寡核苷酸。

这一特性使其在LC-MS/MS分析中，能够显著提高mRNA序列的覆盖率和准确性。

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在LC–MS/MS技术中使用RNase 4

可对mRNA进行全面的分析

帽结构检测：通过互补的DNA探针阻断RNase 4切割，从而识别并检测5´ mRNA 末端的相对丰度。使用含有亲和标签的探针分离切割产物，随后进行LC–MS/MS分析。仅需通过简单的实验设计，RNase 4即可产生可预测的、位点特异性的5´ 端产物。

序列分析：为了验证mRNA序列及其修饰状态，使用RNase 4充分消化样品，产生一系列大小适中的特定寡核苷酸进行LC–MS/MS分析。通过将观察到的寡核苷酸与参考序列进行比对，可以生成覆盖图谱。同时额外使用一种或多种RNases（例如 RNase T1）进行平行消化实验，可以提升mRNA的整体覆盖度。

尾长度分析：通过切割和释放poly(A) 尾并进行长度分析，RNase 4可用于评估 mRNA 3´端。

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在LC–MS/MS技术中使用RNase 4

改善mRNA序列表征

A：RNase 4消化实验流程示意图。RNA样品在3M尿素（用户自备）中，90℃加热变性10分钟。尿素浓度稀释至1M后，在1X NEBuffer™ r1.1（NEB #M1284）中进行反应。NEBuffer r1.1以10X原液形式提供。消化得到的寡核苷酸库直接用于LC–MS/MS分析。

B：分别使用RNase 4或RNase T1对FLuc mRNA进行两次独立消化实验，获得具有代表性的序列覆盖图谱。FLuc mRNA由HiScribe^® T7（NEB #E2040）试剂盒合成。覆盖图谱中的彩条表示寡核苷酸匹配到参考序列（X轴）的特定位置。图中标注了序列覆盖度百分比。

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使用RNase 4进行mRNA 5´端分析的

实验流程概览

1：在选定的UA或UG切割位点上游，设计生物素标记的DNA寡核苷酸探针，使其与RNA的5´端杂交。由于RNase 4具有单链RNA特异性，因此DNA:RNA杂交双链区内的潜在切割位点都会受到保护而阻碍切割。

2：RNase 4消化后，可以通过链霉亲和素磁珠（NEB #S1420）捕获探针杂交的mRNA 5´端产物。

3：洗脱富集到的DNA:RNA双链，并进行UHPLC–MS/MS分析。

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使用RNase 4进行mRNA 5´端分析时，

使实验设计和数据处理变得简单

A：RNase H的切割位点特异性难以预测，与其相比，RNase 4在切割位点的选择上更灵活，且特异性更好。此外，RNase H实验流程需要精心设计和优化嵌合的 RNA-DNA探针，而RNase 4实验流程仅使用DNA探针。通过5´端或3´端偶联生物素或脱硫生物素，可以在LC–MS/MS分析之前通过链霉亲和素富集探针杂交的片段。

B：如图A所示，使用RNase 4或RNase H对FLuc mRNA进行两次独立实验，获得的 5´端切割产物的代表性热图。

C：预估5´端加帽产物及其中间体的分布情况。误差条代表两个独立实验的标准差。

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根据RNA的序列和修饰情况调整反应条件，RNase 4可以获得更好的比对结果

图中显示了长度为 878（红色）或 4,938 个核苷酸（蓝色）的 RNA 的结果。

使用HiScribe T7高效RNA合成试剂盒（NEB #E2040），用同源m1φTP代替 UTP，通过体外转录合成长度为4,938个核苷酸的m1φ完全取代转录本（黄色）。为了获得最大的序列覆盖率，应根据经验确定RNase 4的用量，这与其他用于LC–MS/MS序列比对的RNase类似。一般来说，长度更长和修饰更多的RNA需要更多单位的酶才能获得最佳的比对覆盖度。然而，若RNase 4过量使用或温育时间过长，未必能获得最高的序列覆盖度，反而可能导致假消化。RNase 4（NEB #M1284）以50U/µl的溶液形式提供。