首先作者使用单细胞甲基化测序（snmC-seq3）和多组学测序（snm3C-seq）技术从全脑的117个解剖区域生成了301,626个甲基组以及176,003个染色质构象结合的甲基组轮廓，建立了一个覆盖全脑的单细胞DNA甲基组和3D多组学图谱。

图1.单细胞 DNA 甲基化组和多组学图谱绘制了整个小鼠大脑的细胞和基因组多样性。a.工作流程：展示了用于snmC-seq3和snm3C-seq的细胞分离、核酸提取和文库制备的流程。b.大脑解剖区域：从18个冠状切片（600μm厚）中解剖出的117个区域，这些区域被分为10个主要的大脑区域。每个解剖区域都注册到了3D CCF3上。c.细胞图谱：基于甲基化数据的迭代聚类，展示了snmC和snm3C数据集的细胞图谱。左侧的t-SNE图按模态着色，中间的图聚合到4,673个细胞群中心，并按274个细胞亚类着色。右侧展示了来自BICCN的全脑数据集的跨模态整合。d.基因组图谱：以Tle4基因为例，展示了全脑中五种模态（mCH/mCG分数、染色质构象、可及性和基因表达）的伪批量轮廓。

      然后，研究人员通过对小鼠大脑单细胞的甲基化数据（mC和m3C数据集）进行分析，来界定基于DNA甲基化图谱的细胞分类。作者将甲基组数据与大脑整体单细胞转录组数据集进行了迭代整合，最终根据30个基于转录组的类型和274个子类成功标注了mC基础的细胞群组。针对全脑进行了一个以甲基化组为基础的细胞类型分类。

图2.小鼠大脑中单细胞DNA甲基化和多组学数据的整合分析。a.细胞群中心的t-SNE图：展示了细胞群中心的t-SNE（t-distributed stochastic neighbour embedding）图，颜色表示不同的细胞类别。b.细胞水平的t-SNE图：展示了细胞水平的t-SNE图，颜色表示117个解剖区域。c.3D CCF注册和每个主要区域的细胞t-SNE图：展示了3D CCF（可能指某种3D细胞分类框架）注册和每个主要区域的细胞t-SNE图，颜色表示不同的细胞亚类。d.大脑解剖区域的细胞亚类和神经递质组成：展示了每个大脑解剖区域的细胞亚类（顶行）和神经递质组成（底行）。e.跨模态整合的t-SNE图：展示了所有神经元的整合t-SNE图。f.大脑宽范围的簇映射图：展示了snmC-seq和scRNA-seq数据集之间的簇映射图，基于迭代整合。图中的点表示mC簇（x轴）和RNA簇（y轴）之间的链接，颜色表示子类别。g. 细胞类型特异性的CpG DMRs(differentially methylated regions)：展示了每个细胞亚类中CpG DMRs的mCG分数（左侧）和染色质可及性（右侧）的点图。

      随后，研究人员使用MERFISH技术，在甲基化组和MERFISH数据集中的神经元之间进行跨模态整合，估算每个甲基化核的空间位置。研究人员设计了500个基因的panel，这些基因是基于细胞类型和在甲基化的差异性选择的。使用51个冠状切片和390万个细胞包含的MERFISH数据集和甲基化数据集，通过整合分析，将甲基化组数据集中的细胞与MERFISH数据集的空间位置匹配，从而在不同脑区进行甲基化位置的准确判断。此外，这一部分的分析还揭示了不同脑区间以及脑内部不同脑神经元类型之间DNA甲基化的显著空间多样性，从而证实了表观遗传多样性与转录多样性的空间一致性。这为理解大脑中的细胞类型特异性表达模式及其在空间上的分布提供了新的见解。

图3.小鼠大脑中DNA甲基化与空间转录组数据的整合。a. mC-MERFISH整合工作流程：展示了将甲基化细胞与MERFISH数据集整合的工作流程，以及如何将甲基化细胞的空间位置嵌入到大脑结构中。b. 空间映射的甲基化细胞图谱：通过与MERFISH数据的整合，展示了甲基化细胞在大脑不同区域的空间分布，这些区域按照解剖学位置着色。c. 细胞亚类的空间分布：展示了特定切片中谷氨酸能神经元和其他神经元的细胞亚类空间分布。d. 神经元基因及其相关DMRs的空间表观遗传模式：以Elavl2和Rasgrf2基因为例，展示了基因体中的mCH分数、DMR的mCG分数以及基因表达的空间模式。右侧的热图显示了DMR与基因之间的标准化接触强度。e. 基因体DMR与基因表达的关联：展示了Negr1基因及其相关DMRs在大脑皮层区域的空间表观遗传模式。

       最后，文章分析了染色质构象动态，基因调控网络和异构体表达。研究人员发现染色质区域的转换与DNA甲基化水平变化相关，特别是在神经发育中起重要作用的基因。同时构建了一个全脑神经细胞的基因调控网络，预测了TFs与其目标基因之间的调控关系。研究人员探讨了内源性DNA甲基化和染色质构象模式与基因异构体表达之间的关联，这有助于理解在整个大脑神经元中基因表达调节的复杂机制。

图4.小鼠大脑中染色质构象动态变化与DNA甲基化之间的相关性。a.展示了染色体2的染色质构象矩阵的Pearson相关系数（PCC）热图。b.展示了不同细胞亚群（如C1和C2）的染色质区域分数和Celf2基因座的甲基化胞嘧啶（mCG）分数的t-SNE图。c.展示了100-kb染色质区域分数与相应区域mCG分数（x轴）和分数标准差（y轴）之间的散点图。d.展示了与负相关染色质区域分数相关的基因的功能富集分析。e.展示了Lingo2基因座的染色质接触矩阵的标准化视图。f.展示了Lingo2基因座的转录起始位点（TSS）区域的topologically associated domain（拓扑关联域，TAD）边界概率和mCH分数的t-SNE图。g.展示了长基因和短基因周围25-kb窗口的平均TAD边界概率。h.展示了每个长基因转录本最负相关的边界位置的散点图，y轴是25-kb窗口边界概率与转录本mCH分数之间的PCC，x轴是相对于转录本的基因组位置。i.展示了使用ANOVA分析的染色质接触强度方差热图，以及Lingo2基因座mCH分数与高度可变互作接触强度之间的PCC热图。j.展示了基因座内、上游和下游互作与基因mCH分数之间的相关性。k.展示了所有长基因周围显著相关互作的累积视图。l.展示了特定位点上基因特异性染色质景观的概览。