商业化限制性内切酶的出现，使DNA测序的梦想得以实现。限制性内切酶的广泛应用，也成为生命科学迈向分子水平的另一个重要里程碑。

NEB始终坚持“Scientists for Scientists”理念，不断完善现有的限制性内切酶产品性能及其在新技术中的衍生应用。

通常，PCR反应后还要对产物进行酶切才能进行下一步工作。为了方便，可以将内切酶直接加到PCR反应产物中，而省略纯化PCR产物的步骤。

需要注意的是，聚合酶在内切酶切割DNA后仍有活性，并能改变切割的DNA片段末端，对后续的连接反应造成影响。含有限制性内切酶识别位点的引物在酶消化过程中有竞争抑制作用。在非最佳条件下进行酶切反应容易出现星号活性。

如果遇到上述问题，则需用乙醇沉淀，酚/氯仿抽提或离心柱纯化DNA。

为了解不同内切酶对识别位点以外最少保护碱基数目的要求，NEB采用了一系列含识别序列的短双链寡核苷酸作为酶切底物进行实验。

实验结果表明：通常在识别位点两端至少需要加上6个保护碱基，来确保酶切反应的进行。

“近末端碱基对数”指的是从识别位点到DNA末端的碱基对数，但并不包括最初切割位点处留下的单链突出碱基。

尚没有证据表明单链核苷酸能否提高切割效率，因此在设计PCR引物时应至少加上6个额外碱基。不同实验中的切割效率会有所不同，但变动范围一般不会超过10%。

内切酶对不同底物DNA的切割效率不同。若要完全切割超螺旋DNA，如pBR322、pUC19和pLITMUS等，所需酶量一般比切割线性 λDNA要多。通常在标准反应体系中切割超螺旋DNA所需的酶量是切割 λDNA 的3－5倍。

很早人们就知道，某些酶可以切开单链DNA。从内切酶和双链DNA相互作用的几何结构来看，在分子水平上，内切酶几乎不可能识别并切开单链DNA。而某些酶之所以可以切开单链DNA，很可能是因为这些酶识别了这些单链DNA上多个回文结构之间暂时形成的双链DNA。

因此，单链DNA的切割受很多因素的影响，包括：DNA上识别位点的数目、这些位点之间的距离、瞬时二聚体的稳定性（富含GC的底物要比富含AT的单链 DNA 底物切割效率高）以及在识别位点之外有多少个保护碱基等等。

识别序列相同的限制性内切酶即为同裂酶。第一个被发现的内切酶称之为原酶，后来发现的所有识别序列相同的内切酶都称为原酶的同裂酶。

下表列出了已经商品化内切酶的同裂酶，并特别指出了NEB可提供的同裂酶名称。

所有识别序列用碱基单字母表示，方向为5´→3´，切割位点用“/”标示。

“^”表示同裂酶有不同的酶切位点（不完全同裂酶）；

“⊗”表示目前此酶没有商品化。

不完全同裂酶（Neoschizomer）是同裂酶中的一部分，与原酶相比，虽然识别序列相同，但是切割位点不同。

就像AatII（识别序列为：GACGT↓C）和ZraI（识别序列为：GAC↓GTC）互为不完全同裂酶，而HpaII（识别序列为：C↓CGG）和MspI（识别序列为：C↓CGG）则为完全同裂酶（Isoschizomer）。

但这个类似概念延伸到甲基转移酶时并不适用，因为这种情况下酶间的差异无法轻易界定，且其特性也没有经过确切验证。

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